一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法技术

本公开涉及一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，还涉及一种用于筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的试剂盒及系统。剂的试剂盒及系统。剂的试剂盒及系统。

【技术实现步骤摘要】
一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法


[0001]本公开属于食品、环境、药学与医学领域，具体涉及一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，还涉及一种用于筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的试剂盒及系统。

技术介绍

[0002]乙酰胆碱酯酶，又称真性胆碱酯酶，简称AChE，是生物神经传导过程中的一种关键性酶。AChE在胆碱能神经突触间能降解乙酰胆碱(ACh)，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。目前已知的有机磷酸盐类(OPs)神经毒物质、氨基甲酸酯(CM)农药和阿尔茨海默病(AD)治疗药物都是以AChE为重要靶点的，它们分别通过抑制正常和病理性升高的AChE活性诱发神经毒效应或改善AD的认知功能。OPs是最大的一类AChE抑制剂(AChEI)，目前在全世界使用的数百种产品中都发现了相关化合物，包括杀虫剂、落叶剂、阻燃剂、工业溶剂、润滑剂、增塑剂、燃料添加剂、神经毒类化学战剂以及AD处方药美曲磷脂。得益于杀虫剂等农药在提高农业生产力和控制致命病媒传播疾病的巨大优势，并且伴随快速的工业化的发展，OPs类物质被广泛使用。据统计，每年全球约有10亿磅的OPs被释放到环境、食品和水供应中，使OPs已成为能在环境以及动物和人体组织中检测到的最常见的合成化学品之一。由此带来日益严重的环境、生态问题，对人类健康和公共安全构成巨大威胁。另外，面对日益严峻的全球人口老龄化问题和远未满足的AD治疗需求，作为确证的AD治疗药物，新型AChEI(非有机磷类)仍然是AD药物研发的重点。因此，筛查和精准表征已知和潜在的AChEI(包括有机磷类神经毒剂)对于环境、食品安全的预警、潜在毒性物质的认识、中毒的精准救治以及更高效AD新药的研究都具有重要的意义。
[0003]迄今为止，常用的AChEI的筛查方法主要有三类，即基于已知OP结构的测定、基于AChE活性抑制的分析以及基于OP免疫原性的免疫分析。由于制备强亲和性和高特异性抗体受限，免疫分析方法不仅在成功检测低水平的OPs面临挑战，也无法区别不同结构的OPs。基于化学结构的分析主要采用色谱法，如液相色谱(LC)、液相色谱
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质谱(LC
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MS)、液相色谱
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串联质谱(LC
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MS/MS)、气相色谱(GC)和气相色谱
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质谱(GC
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MS)，灵敏度高(纳摩尔浓度范围内的检测限)，是痕量定量分析的首选方法，但该方法仅适合已知分子，通量低、不适合大规模筛查，且技术耗时、设备昂贵，须由训练有素的技术人员执行。酶活性抑制法是基于AChE被抑制，通过测定暴露于待测样品之前和之后的酶活性可以检测AChEI。酶活性通常通过埃尔曼比色分析法、放射性分析法、荧光分析法\电化学分析法、或化学发光法进行测量。这些方法成本低、通量高、分析速度快，是经典方法(GC/MS、LC/MS)的最有希望的替代方法，然而，该方法对一些OPs化合物暴露后酶活性的变化不敏感，也严重限制了这些方法的检测灵敏度。此外，从高效筛查AChEI的角度来看，上述各种方法仅能在已知结构或酶分子水平上对待测化学品提供单一表征，无法提供潜在有毒分子的生物学表征、为准确预警和高效救治的指导提供多维信息。
[0004]公开内容
[0005]本公开涉及一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，包括：
[0006]1)使待筛查样品与乙酰胆碱酯酶混合；
[0007]2)使步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合；
[0008]3)使报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS与步骤2)所得混合体系接触；
[0009]4)检测报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS被激活的程度。
[0010]在某些实施方案中，所述报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS的激活程度表示为报告细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核的程度。若报告细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核，判断待筛查样品中含有乙酰胆碱酯酶抑制剂。还可以根据细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核的数目对乙酰胆碱酯酶抑制剂对于乙酰胆碱酯酶的抑制活性进行定量。
[0011]在某些实施方案中，本公开所述待筛查样品可以为化学品、食品(例如各种肉类、蔬菜、茶叶等)、环境中的有机磷农药、AD治疗药物、神经毒剂等。
[0012]在某些实施方案中，所述乙酰胆碱为碘代乙酰胆碱，所述乙酰胆碱酯酶为重组人乙酰胆碱酯酶。
[0013]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤1)中，使待筛查样品与乙酰胆碱酯酶在第一溶剂中混合。
[0014]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤2)中，使步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱在第二溶剂中混合。
[0015]在某些实施方案中，所述第一溶剂、第二溶剂相同或不同，各自独立地为适合报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS正常生长的培养基，例如DMEM高糖培养基。
[0016]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合后，乙酰胆碱酯酶在所得混合体系中的初始浓度(未与乙酰胆碱反应时的浓度)为0.005～0.018U/mL，优选为0.007～0.015U/mL，进一步优选为0.01U/mL。
[0017]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合后，乙酰胆碱在所得混合体系中的初始浓度(未与乙酰胆碱酯酶反应时的浓度)为10～1000nM，优选为30～800nM，进一步优选为30～500nM，进一步优选为30～400nM，进一步优选为30～300nM，进一步优选为30～200nM，进一步优选为30～100nM。
[0018]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤1)中，待筛查样品与乙酰胆碱酯酶在25～40℃(例如30℃，32℃，35℃，37℃)的温度条件下混合10～60min，例如20min，25min，30min，35min，40min，50min。
[0019]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱在25～40℃(例如30℃，32℃，35℃，37℃)的温度条件下混合10～60min，例如20min，25min，30min，35min，40min，50min。
[0020]在某些实施方案中，本公开所述的筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法的步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合后，乙酰胆碱酯酶在所得混合体系中的初始浓度(未与乙酰胆碱反应时的浓度)为0.005～0.018U/mL，乙酰胆碱在所得混合体系中的初始浓度为10～1000nM(例如30～800本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛查乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，包括：1)使待筛查样品与乙酰胆碱酯酶混合；2)使步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合；3)使报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS与步骤2)所得混合体系接触；4)检测报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS被激活的程度。2.权利要求1所述的方法，其中报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS的激活程度表示为报告细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核的程度，若报告细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核，判断待筛查样品中含有乙酰胆碱酯酶抑制剂，优选地，根据细胞内NFATc1
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EGFP从胞质转位至细胞核的数目对乙酰胆碱酯酶抑制剂对于乙酰胆碱酯酶的抑制活性进行定量。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述乙酰胆碱为碘代乙酰胆碱，所述乙酰胆碱酯酶为重组人乙酰胆碱酯酶。4.权利要求1或2所述的方法，其中：步骤1)中，使待筛查样品与乙酰胆碱酯酶在第一溶剂中混合；步骤2)中，使步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱在第二溶剂中混合；所述第一溶剂、第二溶剂相同或不同，各自独立地为适合报告细胞M3:NFATc1
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EGFP U2OS正常生长的培养基，例如DMEM高糖培养基，优选地，步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合后，乙酰胆碱酯酶在所得混合体系中的初始浓度为0.005～0.018U/mL，优选为0.007～0.015U/mL，进一步优选为0.01U/mL，优选地，步骤2)中，步骤1)中所得混合体系与乙酰胆碱混合后，乙酰胆碱在所得混合体系中的初始浓度为10～1000nM，优选为30～800nM，进一步优选为30～500nM，进一步优选为30～400nM，进一步优选为30～300nM，进一步优选为30～200nM，进一步优选为30～100nM。5.权利要求1
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4任一项所述的方法，其中优选地，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：马波，王莉莉，李治，郭磊，徐华，谢剑炜，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：