一种快速测定狂犬病毒滴度的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定狂犬病毒滴度的方法，属于生物医药技术领域。所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero细胞)作为检测狂犬病病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对狂犬病毒进行滴定，再结合荧光染色法判断细胞感染情况，最终计算得出病毒的滴度。本发明专利技术提供的测定方法采用免疫荧光法试验时间为22～24小时，与14天的小鼠脑内滴定法比较，大大缩短了病毒滴度的测定时间。经验证，本发明专利技术的方法稳定性良好，不同时间和不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性好，在狂犬病疫苗研发和生产中具有非常好的应用前景。产中具有非常好的应用前景。产中具有非常好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种快速测定狂犬病毒滴度的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种快速测定狂犬病毒滴度的方法。

技术介绍

[0002]狂犬病毒的定量测定方法主要有小鼠脑内滴定法、组织半数感染量终点滴定法(TCID
50
)等。小鼠脑内滴定法与组织半数感染量终点滴定法(TCID
50
)测量比较，试验时间长，对实验人员要求高，导致产品研发周期延长；实验中应用大量的试验动物，由于动物个体差异导致试验结果精确度差。组织半数感染量终点滴定法(TCID
50
)是WHO狂犬试验技术指南中作为脑内滴定法的替代方法。WHO试验方法中用到仓鼠肾细胞(BHK
‑
21)，该细胞需要从细胞保藏中心引进，按照2020年版《中国药典》三部通则《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》需要建立检定细胞库并进行管理，工作量比较繁琐。

技术实现思路

[0003]为解决
技术介绍
中的技术问题，本专利技术的目的是提供了一种快速测定狂犬病毒滴度的方法。
[0004]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0005]本专利技术提供一种快速测定狂犬病毒滴度的方法，所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero细胞)作为检测狂犬病毒(CTN
‑
1V株)滴度的指示细胞，采用组织半数感染法对狂犬病毒进行滴定，再结合荧光染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度。
[0006]基于上述技术方案，进一步地，所述的方法主要包括以下步骤：/>[0007](1)对狂犬病毒进行10倍系列稀释，将多个不同稀释度的狂犬病毒稀释液分别加入细胞培养板内；
[0008](2)将生长成单层的Vero细胞消化，加入培养基，分散成细胞悬液，然后将细胞悬液加入到步骤(1)的细胞培养板内，混匀后，转入培养箱中，培养20～48小时；
[0009](3)弃去培养液，使用缓冲液洗涤细胞，然后加入固定液，于
‑
10℃以下条件固定10～60min；
[0010](4)固定结束后弃去固定液，加入FITC标记的抗狂犬病毒特异性抗体，孵育20～120min；
[0011](5)弃去特异性抗体，使用缓冲液清洗1～3次，于荧光显微镜下观察，记录每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Reed&Muench法计算狂犬病毒的滴度。
[0012]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的狂犬病毒包括CTN
‑
1V。
[0013]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中多个不同稀释度包括10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8、10
‑9和10
‑
10
稀释度。
[0014]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中每个稀释度设3
‑
10个复孔。
[0015]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的细胞培养板包括24孔细胞培养板、48孔细胞培养板和96孔细胞培养板。
[0016]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中消化过程使用的消化液为含有0.25％胰蛋白酶的PBS缓冲液。
[0017]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的培养基为含有1～10％胎牛血清的MEM培养基。
[0018]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的细胞悬液的细胞浓度为1～5
×
105个/ml。
[0019]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的细胞悬液与狂犬病毒稀释液的体积比为1:2～2:1。
[0020]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的培养在37.0℃
±
1.0℃，5％ CO2条件下进行。
[0021]基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述的固定液包括甲醇、甲醛、戊二醛和丙酮。
[0022]基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)和步骤(5)中所述的缓冲液包括PBS缓冲液和Tris
‑
盐酸缓冲液。
[0023]基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中所述的孵育在37.0℃
±
1.0℃条件下进行。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0025]1)本专利技术应用本公司已有狂犬病毒(CTN
‑
1V株)适应细胞即Vero细胞作为指示细胞，替代BHK
‑
21细胞，增加了方法灵敏度；
[0026]2)本实验中病毒感染Vero细胞后20小时即可检测到清晰的荧光现象，远远优于现有文献报道的72小时观察试验结果，明显缩短试验时间，可以实现快速检测狂犬病病毒；
[0027]3)本专利技术的测定结果具有稳定性，不同时间、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高。
[0028]4)本专利技术可作为小鼠脑腔滴定法的体外替代方法，符合国际动物福利组织提倡的3R原则，增加动物福利。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
[0030]图1为实施例2中Vero细胞感染CTN
‑
1V株后的细胞荧光图，其中，(a)为Vero细胞感染CTN
‑
1V株72小时，(b)为Vero细胞感染CTN
‑
1V株20小时，(c)为Vero细胞感染CTN
‑
1V株48小时，(d)为Vero细胞对照。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本专利技术的部分实施案例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施案例均落入本专利技术的保护范围。
[0032]实施例1
[0033]冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)收获液(CTN
‑
1V株)病毒滴度的测定，包括以下步骤：
[0034]1)将CTN
‑
1V株病毒培养收获液进行10倍系列稀释，分别取10
‑3、10
‑4、10
‑5稀释度50μL至96孔细胞培养板中，每个稀释度设8个复孔；
[0035]2)取培养至单层且状态良好的Vero细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，分散，计数后配制成终浓度为3
×
105个/ml的细胞悬液，取细胞悬液按照50μl/孔加入到含CTN
‑
1V株病毒的细胞培养板中，轻轻震荡混匀后，置于37.0℃
±
1.0℃，5％ CO2培养箱中培养20～24h；
[0036]3)培养结束后，取出细胞培养板，弃培养液，PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤1次，加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速测定狂犬病毒滴度的方法，其特征在于，所述方法以非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero细胞)作为检测狂犬病毒滴度的指示细胞，采用组织半数感染法对狂犬病毒进行滴定，再结合荧光染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法主要包括以下步骤：(1)对狂犬病毒进行10倍系列稀释，将多个不同稀释度的狂犬病毒稀释液分别加入细胞培养板内；(2)将生长成单层的Vero细胞消化，加入培养基，分散成细胞悬液，然后将细胞悬液加入到步骤(1)的细胞培养板内，混匀后，转入培养箱中，培养20～48小时；(3)弃去培养液，使用缓冲液洗涤细胞，然后加入固定液，于
‑
10℃以下条件固定10～60min；(4)固定结束后弃去固定液，加入FITC标记的抗狂犬病毒特异性抗体，孵育20～120min；(5)弃去FITC标记的抗狂犬病毒特异性抗体，使用缓冲液清洗1～5次，于荧光显微镜下观察，记录每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Reed&Muench法计算狂犬病毒的滴度。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的狂犬病毒包括CTN
‑
1V。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中多个不同稀释度包括10
‑1、10
‑2、10
‑3、10

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建民，刘媛媛，周蕾，高洪霞，柴晶，陈楠，刘阳，段尉琪，李秋宏，
申请(专利权)人：大连雅立峰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：