一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法技术

一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法，包括如下步骤：采集自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞，对其进行CFSE染色处理；将PBMC与调节性T细胞按照细胞数目比1

【技术实现步骤摘要】
一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法


[0001]本专利技术属于细胞治疗领域，尤其涉及一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法。

技术介绍

[0002]免疫性疾病是由于患者自身免疫紊乱导致多种器官组织功能受损，其疾病谱广泛，包括自身免疫糖尿病、系统性红斑狼疮等疾病。自身免疫性疾病也被列入我国中长期科技发展纲要的十类重大疾病之一。我国人口基数大，绝对患病人数多。免疫性疾病不仅给个人和家庭带来了沉重的经济负担，还对国家的经济发展产生了严重影响。但目前其治疗现多依赖于免疫抑制剂等传统方法，但疾病主因—免疫调节紊乱并未得到解决。
[0003]调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类特殊的T细胞亚群，通过抑制和调控效应T细胞维持动态免疫平衡。从上世纪末日本学者分离并鉴定了调节性T细胞后，其已成为近年来免疫领域研究的热点。国外已启动多项调节性T细胞相关的临床试验，其中较有代表性的调节性T细胞治疗移植物抗宿主病证实了该疗法应用于免疫性疾病的安全性及有效性。然而，调节性T细胞治疗免疫性疾病在中国仍是空白。调节性T细胞治疗能够使免疫系统重新达到平衡，阻止自身免疫反应对器官组织的进一步损伤，改善甚至逆转病情，从根本上治愈免疫性疾病。
[0004]越来越多的研究表明脐血中富含调节性T细胞，因其具未受抗原激活多为T细胞，体外扩增后的Treg细胞功能良好且免疫原性低，因而为免疫性疾病治疗带来了新希望。本团队前期建立了脐血调节性T细胞的体外分离、扩增和功能鉴定方法并获批国家专利技术专利(专利号：201710613737.4)，并在国际上首次开展了脐血调节性T细胞治疗自身免疫糖尿病的临床研究，初步明确了脐血调节性T细胞治疗自身免疫糖尿病的安全性和有效性的评估。2019年和2020年，美国青少年糖尿病联盟(JDCA)分别发表年度报告关于全球治疗1型糖尿病的技术，“脐血调节性T细胞“治疗技术连续被评为全球领先技术。目前通过应用脐血Treg细胞来治疗免疫性疾病的临床试验在全球尚属空白。本实验室从2016年开始开展脐血调节性T细胞治疗自身免疫糖尿，随访结果发现不同患者的治疗效果不尽相同。因此亟待建立一种治疗前预测脐血调节性T细胞治疗效果的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是：细胞库中的脐血调节性T细胞的来源不同，不同患者的治疗效果不尽相同，正常的治疗需要经过长期随访才能明确疗效，所以需要提前预测脐血调节性T细胞临床治疗效果，以此来针对不同患者进行不同来源的脐血调节性T细胞进行匹配。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
[0007]一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法，包括如下步骤：
[0008]步骤一：采集自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞，对其进行CFSE染色处理；
[0009]步骤二：将所述步骤一得到的PBMC与调节性T细胞按照细胞数目比1
‑
8∶1进行共培养；
[0010]步骤三：用流式法检测脐血调节性T细胞对所述自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞增殖的抑制能力，其结果显示抑制能力越强，则表明该脐血调节性T细胞对该自身免疫糖尿病患者的临床治疗效果越好。CFSE标记PBMC后，细胞增殖的越多CFSE阴性的PBMC细胞就会越多，其占所有PBMC的比例也会越大。
[0011]上述的方法，优选的，所述步骤一具体包括如下步骤：采集自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞，采用无血清培养基重悬细胞，采用CellTrace
TM CFSE细胞增殖试剂盒中18uL DMSO+5mM CellTrace
TM CFSE的混合液对重悬后的细胞进行CFSE染色，进行第一次避光孵育，加入洗涤液后进行第二次避光孵育，离心，用含有10％FBS的无血清培养液重悬细胞，即得CFSE染色处理后的PBMC细胞。
[0012]优选的，所述CellTrace
TM CFSE细胞增殖试剂盒包含：十份瓶装的CellTrace
TM CFSE、CFSE和1份瓶装的DMSO。
[0013]优选的，所述第一次避光孵育的条件为：37℃避光孵育20min；所述第二次避光孵育的条件为：37℃避光孵育5min；所述洗涤液包含：无血清培养液+10％FBS。
[0014]优选的，所述步骤二中进行共培养时，以单独CFSE处理的PBMC细胞设为阴性对照组，CFSE染色处理的PBMC细胞组设为阳性对照组。
[0015]优选的，所述脐血调节性T细胞通过以下方法制备得到：
[0016](1)将一次扩增后的冻存脐带血调节性T细胞进行复苏，并用无血清培养液对细胞进行重悬得到重悬液；
[0017](2)将所述重悬液加入扩培液进行二次扩增培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养13天以上；
[0018]所述扩培液按体积份数比计包括无血清培养液70.54％
‑
85.27％、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5％
‑
5％、青霉素
‑
链霉素溶液1％
‑
2％、L
‑
谷氨酰胺1％
‑
2％、50
‑
100umol/L2
‑
巯基乙醇0
‑
1000U/ml重组白介素
‑
2、50
‑
200nmol/L雷帕霉素、AB血清10％
‑
20％。
[0019]上述高复苏率的冻存脐带血调节性T细胞的体外扩增方法，优选的，所述一次扩增后的冻存脐带血调节性T细胞的获取方法包括如下步骤：制备调节性T细胞，然后在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行一次扩增培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养18天以上。
[0020]优选的，制备调节性T细胞的方法包括以下步骤：
[0021]S1、从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数，离心除去上清液，冻存，复苏并计数；
[0022]S2、离心除去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5
×
107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL
‑
6mL，即得到重悬液；
[0023]S3、将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中，加入CD25 Positive Selection Cocktail，孵育5min；涡旋Releasable Rapidsphere 30s以上，直至磁珠团块消失；加入Releasable Rapidsphere；加入CD4
+
T细胞富集抗体混合物，孵育5mim；加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2
‑
3次；将无菌管放置于磁极上，孵育10mim；准备离心管收集CD25
‑
细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预测脐血调节性T细胞临床治疗效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：采集自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞，对其进行CFSE染色处理；步骤二：将所述步骤一得到的PBMC与调节性T细胞按照细胞数目比1
‑
8∶1进行共培养；步骤三：用流式法检测脐血调节性T细胞对所述自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞增殖的抑制能力，其结果显示抑制能力越强，则表明该脐血调节性T细胞对该自身免疫糖尿病患者的临床治疗效果越好。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括如下步骤：采集自身免疫糖尿病患者的PBMC细胞，采用无血清培养基重悬细胞，采用CellTrace
TM
CFSE细胞增殖试剂盒中18uL DMSO+5mM CellTrace
TM
CFSE的混合液对重悬后的细胞进行CFSE染色，进行第一次避光孵育，加入洗涤液后进行第二次避光孵育，离心，用含有10％FBS的无血清培养液重悬细胞，即得CFSE染色处理后的PBMC细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CellTrace
TM
CFSE细胞增殖试剂盒包含：CellTrace
TM
CFSE、CFSE和DMSO。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一次避光孵育的条件为：37℃避光孵育20min；所述第二次避光孵育的条件为：37℃避光孵育5min；所述洗涤液包含：无血清培养液+10％FBS。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中进行共培养时，以单独CFSE处理的PBMC细胞设为阴性对照组，CFSE染色处理的PBMC细胞组设为阳性对照组。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐血调节性T细胞通过以下方法制备得到：(1)将一次扩增后的冻存脐带血调节性T细胞进行复苏，并用无血清培养液对细胞进行重悬得到重悬液；(2)将所述重悬液加入扩培液进行二次扩增培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养13天以上；所述扩培液按体积份数比计包括无血清培养液70.54％
‑
85.27％、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5％
‑
5％、青霉素
‑
链霉素溶液1％
‑
2％、L
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谷氨酰胺1％
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2％、50
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100umol/L 2
‑
巯基乙醇0
‑
1000U/ml重组白介素
‑
2、50
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200nmol/L雷帕霉素、AB血清10％
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20％、10
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1000U/mL IL
‑
2。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次扩增后的冻存脐带血调节性T细胞的获取方法包括如下步骤：制备调节性T细胞，然后在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行一次扩增培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养18天...

【专利技术属性】
技术研发人员：周智广，俞海波，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：