一种针对BCR-ABL1融合突变的抑制剂的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种针对BCR

【技术实现步骤摘要】
一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法


[0001]本专利技术涉及医疗领域，更具体地说，涉及一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法。

技术介绍

[0002]慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML)也称为慢性髓细胞白血病、慢性髓性白血病或慢性粒细胞白血病)是一种骨髓增殖性肿瘤，表现为成熟和未成熟的粒细胞失调控的生成和不受控制的增殖，细胞分化大体正常；
[0003]CML与2个基因的融合有关：BCR(位于22号染色体)基因和ABL1(位于9号染色体)基因形成BCR
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ABL1融合基因。这种异常融合通常是由于9号染色体和22号染色体相互易位，即t(9；22)(q34；q11)，产生一种异常的22号染色体，称为费城(Ph)染色体，这种衍生的22号染色体含BCR
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ABL1融合基因；
[0004]BCR
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ABL1融合基因可以产生一种独特的基因产物，即BCR
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ABL1融合蛋白。该蛋白产物包含一个来自正常ABL1的酶促结构域，具有酪氨酸激酶催化活性；相对于正常ABL1的激酶活性受到严格调控，由于与BCR部分融合，BCR
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ABL1的激酶活性增高且呈组成型表达，这种失调控的酪氨酸激酶参与了CML的发病机制；
[0005]尽管BCR
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ABL激活的通路列表看似无休止地扩展，并且在这些通路中揭示的复杂性日益增加，但BCR
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ABL的所有转化功能似乎都取决于其酪氨酸激酶活性；这种先决条件在开发更复杂的靶向治疗方面具有令人难以置信的内在临床潜力；
[0006]第一个上市的BCR
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ABL1的TKI，可选择性抑制c
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ABL1、c
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KIT及PDGFRα/β的酪氨酸激酶活性，但是一线治疗后，还是出现了BCR
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ABL1依赖性和不依赖性的耐药，因此需要对抑制剂进行检测；
[0007]现有技术汇总中，很多是利用纯化的酶在生化水平上检测抑制剂的活性，与生理不相符，另外开发的抑制剂类型一般为ATP的竞争性和非竞争性抑制剂，不适用于体外药物活性的筛选，不适合高通量筛选，检测药物活性的效率还有待提升，为此我们提出一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法。

技术实现思路

[0008]1.要解决的技术问题
[0009]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，它可以实现，适用于体外药物活性的筛选，活性的验证，在细胞水平上反应药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，适合高通量筛选，提高药物活性检测的效率。
[0010]2.技术方案
[0011]为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0012]一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，包括有以下步骤：
[0013]S1：培养细胞；
[0014]S2：病毒包装，包装含有BCR
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ABL1融合基因的病理颗粒；
[0015]S3：稳定细胞株构建，将BCR
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ABL1融合基因病理颗粒逆转录进入细胞中进行培育，获得稳定细胞株；
[0016]S4：体外药效评价，在人体外侧模拟人体状态对细胞株的药效进行评测；
[0017]S5：Sanger测序验证，通过Sanger测序法对样品细胞进行检测验证；
[0018]S6：WB蛋白印迹检测，通过蛋白质印迹法对样品细胞进行检测验证。
[0019]进一步的，所述S1包括有以下步骤：
[0020]S101：预处理工作，对无菌室和培养器皿进行清洗、干燥与消毒，对培养基进行配制、分装及灭菌；
[0021]S102：取材，取出细胞，并进行消化分散细胞和分离处理；
[0022]S103：培养，将上述步骤中经过消化分散细胞和分离处理后的细胞接入培养器皿中，并将培养基置入培养器皿中。
[0023]进一步的，所述S1还包括有以下步骤：
[0024]S104：冻存，将经过S101～S103处理的细胞收集至冻存管中，加入含保护剂的培养基中并进行冻存，并将冻存管保存于液氮中；
[0025]S105：复苏，从液氮中取出冻存管并放入水中进融化复苏。
[0026]进一步的，所述S2包括有以下步骤：
[0027]S201：预制备，制备DNA/转染试剂复合物；
[0028]S202：转染工具细胞，使用293T细胞，将DNA/转染试剂复合物加入到装有包装细胞的培养板中进行培养，并加入滴度增强剂TiterBoost。
[0029]S203：收获病毒，收集转染的培养液，经离心处理去除细胞碎片杂质，并使用聚醚砜蛋白结合过滤膜去除蛋白杂质，获得含有BCR
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ABL1融合基因的病理颗粒。
[0030]进一步的，所述S3包括有以下步骤：
[0031]S301：将BCR
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ABL1融合基因病理颗粒逆转录进入细胞，形成治疗细胞；
[0032]S302：通过选择法或克隆形成法对治疗细胞进行培育，穿代五十次以上获得稳定细胞株。
[0033]进一步的，所述S4包括有以下步骤：
[0034]S401：在人体外侧建立与人体状态相同的培育区；
[0035]S402：将细胞株和录入有BCR
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ABL1融合基因的细胞置入同一个培育区进行培育；
[0036]S403：在细胞株和录入有BCR
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ABL1融合基因的细胞培育50代以后对细胞进行抽样检测，并根据样品细胞对细胞株的药效进行评测。
[0037]进一步的，所述S5包括有以下步骤：
[0038]S501：引物设置，在BCR(位于22号染色体)突变为BCR
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ABL1融合基因的突变位点设置引物；
[0039]S502：对样品细胞进行PCR扩增直接测序。
[0040]进一步的，所述S6包括有以下步骤：
[0041]S601：通过凝胶对样品细胞进行电泳处理；
[0042]S602：通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的样品细胞进行着色；
[0043]S603：通过分析样品细胞着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的样品
细胞中表达情况的信息。
[0044]3.有益效果
[0045]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0046](1)本方案建立了一种体外检测BCR
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ABL1的抑制剂活性的方法，适用于体外药物活性的筛选，活性的验证，其通过模拟了天然病人带有的BCR
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ABL1的靶点结构，在细胞水平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，其特征在于：包括有以下步骤：S1：培养细胞；S2：病毒包装，包装含有BCR
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ABL1融合基因的病理颗粒；S3：稳定细胞株构建，将BCR
‑
ABL1融合基因病理颗粒逆转录进入细胞中进行培育，获得稳定细胞株；S4：体外药效评价，在人体外侧模拟人体状态对细胞株的药效进行评测；S5：Sanger测序验证，通过Sanger测序法对样品细胞进行检测验证；S6：WB蛋白印迹检测，通过蛋白质印迹法对样品细胞进行检测验证。2.根据权利要求1所述的一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，其特征在于：所述S1包括有以下步骤：S101：预处理工作，对无菌室和培养器皿进行清洗、干燥与消毒，对培养基进行配制、分装及灭菌；S102：取材，取出细胞，并进行消化分散细胞和分离处理；S103：培养，将上述步骤中经过消化分散细胞和分离处理后的细胞接入培养器皿中，并将培养基置入培养器皿中。3.根据权利要求2所述的一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，其特征在于：所述S1还包括有以下步骤：S104：冻存，将经过S101～S103处理的细胞收集至冻存管中，加入含保护剂的培养基中并进行冻存，并将冻存管保存于液氮中；S105：复苏，从液氮中取出冻存管并放入水中进融化复苏。4.根据权利要求1所述的一种针对BCR
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ABL1融合突变的抑制剂的检测方法，其特征在于：所述S2包括有以下步骤：S201：预制备，制备DNA/转染试剂复合物；S202：转染工具细胞，使用293T细胞，将DNA/转染试剂复合物加入到装有包装细胞的培养板中进行培养，并加入滴度增强剂TiterBoost。S203：收获病毒，收...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋涛华，傅坚刚，邵悦，
申请(专利权)人：南京科佰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：