一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用。本发明专利技术公开的重组酿酒酵母组成型表达β

【技术实现步骤摘要】
一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用


[0001]本专利技术属于微生物领域，涉及一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用。

技术介绍

[0002]虾青素(3,3
’-
dihydroxy-β,β
′-
carotene-4,4
’-
dione，C
40
H
52
O4，596.84)具有亲脂性和亲水性，也是迄今为止目前自然界中发现的抗氧化性最强的抗氧化剂之一，其抗氧化能力是辅酶Q10的800倍、花青素的700倍、维生素E的550倍。虾青素有两个不对称碳，位于β-紫罗酮环的3、3
’
位置，根据两个手性碳的不同，分为(3R,3
’
R)、(3S,3
’
S)、(3R,3
’
S)3种不同的构型，其中(3S,3
’
S)构型抗氧化能力最强。虾青素具有多个共轭双键，能够清除细胞膜内外的自由基，减少蛋白质、脂质的氧化以及DNA的损伤，保护细胞、延缓衰老，是唯一能通过血脑屏障的一种类胡萝卜素抗氧化剂，对心脑血管、糖尿病、癌症等有积极的治疗和预防作用，被欧美科学家、医学家誉为“健康软黄金”，在医药、保健品、食品和水产养殖等领域具有巨大市场价值。2017年全球虾青素产量约为511.8吨，总产值约为1亿美元，2018年激增至1.5亿美元。预计2024年全球虾青素产值接近3.4亿美元，而中国的虾青素产值将达到近2亿美元，广阔的市场前景也推动着虾青素生物合成技术不断向前发展。/>[0003]目前，被批准用于生物合成虾青素的菌种主要是红发夫酵母和雨生红球藻。红发夫酵母生产(3R,3
’
R)构型的虾青素，这种虾青素的抗氧化能力低，生物活性差，主要用于饲料添加剂。雨生红球藻体内能积累较高浓度构型为(3S,3
’
S)的虾青素，可以用于人类的食品和化妆品中，但是培养条件苛刻，需要在常年具有合适光照的条件下培养，而且周期较长，所以生产经济成本长期高居不下。近年来随着合成生物学的发展，研究人员将目光转向其他遗传背景比较成熟的工程菌。酿酒酵母作为一种公认的安全模式微生物，遗传背景清晰、分子操作工具丰富，能实现高密度发酵和合成高品质的(3S,3
’
S)构型的虾青素，因此实现虾青素在酿酒酵母中的高产在工业生产上将会具有极大的竞争力。但是目前由于从β-胡萝卜素到虾青素合成的这两步网状代谢路径中会积累大量的中间体，限制了虾青素的产量，因此疏通下游网状代谢路径的代谢通量，减少中间体的积累，对提高酿酒酵母中虾青素的合成具有重大意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提高酿酒酵母中虾青素的合成。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一株重组酿酒酵母，其组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW，诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ，将中间产物β-胡萝卜素合成为虾青素。
[0006]在一些实施方案中，上述重组酿酒酵母中，所述组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW所用的组成型启动子为TDH3p，TDH3p的序列如SEQ ID NO:9所示。
[0007]在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ所用的诱导型启动子为Gal1，Gal1的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0008]在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW为泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis DC263)来源的BDC263CrtW，BDC263CrtW的序列如SEQ ID NO:28中第9-734位所示。
[0009]在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ为橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)来源的AaCrtZ，AaCrtZ的序列如SEQ ID NO:25中第9-497位所示。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种酿酒酵母的重组表达载体，包括组成型启动子及其控制下的β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW，以及诱导型启动子及其控制下的β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ。
[0011]在一些实施方案中，上述重组表达载体中，所述组成型启动子为TDH3p，TDH3p的序列如SEQ ID NO:9所示。
[0012]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW下游具有终止子，终止子优选为TDH2t，TDH2t的序列如SEQ ID NO:12所示。
[0013]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述诱导型启动子为Gal1，Gal1的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0014]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ下游具有终止子，终止子优选为ADH1t，ADH1t的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0015]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW为泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis DC263)来源的BDC263CrtW，BDC263CrtW的序列如SEQ ID NO:28中第9-734位所示。
[0016]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ为橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)来源的AaCrtZ，AaCrtZ的序列如SEQ ID NO:25中第9-497位所示。
[0017]在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述重组表达载体为PRS416-ADH1t-AaCrtZ-Gal1-TDH3p-BDC263CrtW-TDH2t，序列如SEQ ID NO:35所示。
[0018]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种构建上述任一所述的重组酿酒酵母的方法，包括将上述任一所述的重组表达载体转入出发酿酒酵母中获得重组酿酒酵母的步骤；
[0019]所述出发酿酒酵母为能合成β-胡萝卜素的酿酒酵母，出发酿酒酵母优选为Scy10026酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0020]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种生产虾青素的方法，包括将上述任一所述的重组酿酒酵母进行发酵培养，使得β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW组成型表达并且在发酵培养过程中添加D-(+)-半乳糖诱导β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ表达以合成虾青素的步骤。
[0021]在一些实施方案中，上述生产虾青素的方法中，所述发酵培养包括将上述任一所述的重组酿酒酵母在初始发酵培养基中进行发酵培养，在例如初始OD
600
＝0.5，30℃、发酵pH5.8-6.2、通气量3.0vvm，溶氧30％、300-500rpm条件下发酵48h，再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组酿酒酵母，其组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW，诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ，将中间产物β-胡萝卜素合成为虾青素。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW所用的组成型启动子为TDH3p；和/或所述诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ所用的诱导型启动子为Gal1。3.一种酿酒酵母的重组表达载体，包括组成型启动子及其控制下的β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW，以及诱导型启动子及其控制下的β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述组成型启动子为TDH3p；和/或所述诱导型启动子为Gal1。5.根据权利要求3或4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为PRS416-ADH1t-AaCrtZ-Gal1-TDH3p-BDC263CrtW-TDH2t，序列如SEQ ID NO:35所示。6.一种构建权利要求1或2所述的重组酿酒酵母的方法，包括将权利要求3-5任一项所述的重组表达载体转入出发酿酒酵母中获得重组酿酒酵母的步骤；所述出发酿酒酵母为能合成β-胡萝卜素的酿酒酵母。7.一种生产虾青素的方法，包括将权利要求1或2所述的重组酿酒酵母进行发酵培养，使得β-胡萝卜素酮化酶基因Crt...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨祖明，王竞辉，张雅萍，张稳，姜西娟，黎源，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：