一种胞外转运维生素D3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胞外转运维生素D3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术首先构建了一株高产角鲨烯的重组酿酒酵母菌株Z1O3，所述重组酿酒酵母强化表达了3

【技术实现步骤摘要】
一种胞外转运维生素D3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用


[0001]本专利技术涉及一种胞外转运维生素D3前体角鲨烯的酿酒酵母菌株构建及其应用，属于发酵工程


技术介绍

[0002]酿酒酵母(S.cerevisiae)是发酵工业最广泛使用的模式微生物之一，具有遗传背景清晰、基因操作方便等诸多优点。酿酒酵母(S.cerevisiae)胞内天然存在的甲羟戊酸途径(MVA pathway)和后角鲨烯途径(post
‑
squalene pathway)使其可以合成角鲨烯、羊毛甾醇、麦角甾醇等具有高附加值的脂类物质，还可通过引入外源基因实现对维生素D3前体(7
‑
DHC)的合成。
[0003]角鲨烯是S.cerevisiae胞内的一种重要平台化合物，与脂类物质合成密切相关，也是维生素D3合成的关键前体和限制性因素。已报道的研究主要通过启动子工程、过表达途径酶、增强辅因子供给等传统代谢工程手段来实现角鲨烯在S.cerevisiae细胞中的高效生产，过量合成的角鲨烯储存在脂滴和过氧化物酶体等细胞器中。但S.cerevisiae胞内复杂的反馈调节机制和存储空间的有限性给角鲨烯产量的进一步提高带来了不小的难度。因此，如何促进角鲨烯向胞外的高效转运，并且进一步提高角鲨烯产量成为研究的难点。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术当中S.cerevisiae胞内的反馈调节机制和有限的胞内储存空间限制了内源性三萜类化合物角鲨烯产量的进一步提高，以及现有技术当中的胞外分泌生产角鲨烯的产量较低的技术问题，本专利技术提供了一种重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母强化表达了3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子的相关基因INO2、Pdr5蛋白和Osh3蛋白；并且敲除了ROX1基因。
[0005]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母通过P
GPD
启动子强化表达tHMG1，通过P
PGK1
启动子强化表达INO2，通过P
TEF1
启动子强化表达ERG20和IDI，通过P
TDH3
启动子强化表达Pdr5，通过P
TEF2
启动子强化表达Osh3。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述强化表达，是指在酿酒酵母BY 4741基因组上强化表达了2个拷贝数的tHMG1、1个拷贝数的IDI、1个拷贝数的ERG20，并且强化表达了1个拷贝数的INO2、1个拷贝数的Osh3和1个拷贝数的Pdr5。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，以酿酒酵母BY 4741为出发菌株。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述tHMG1的Gene ID为42650、所述IDI的Gene ID为855986、所述ERG20的Gene ID为853272、所述INO2的Gene ID为851701、所述ROX1的Gene ID为856178、所述Pdr5蛋白的Gene ID为854324、所述Osh3蛋白的Gene ID为856472。
[0009]本专利技术还提供了上述重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)敲除BY4741基因组上的编码ROX1酶的基因，并将P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
片段整合到BY4741基因组上，构建得到BY4741ΔROX1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
，命名为酿酒酵母Y1；
[0011](2)将P
TEF1
‑
IDI
‑
T
CYC1
片段整合至Y1菌株基因组上，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
911b
‑
P
TEF1
‑
IDI
‑
T
CYC1
，命名为酿酒酵母Y2；
[0012](3)将P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
P
TEF1
‑
ERG20
‑
T
CYC1
片段整合至Y2菌株基因组上，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
911b
‑
P
TEF1
‑
IDI
‑
T
CYC1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
P
TEF1
‑
ERG20
‑
T
CYC1
，命名为酿酒酵母Y3；
[0013](4)将P
PGK1
‑
INO2
‑
T
INO2
片段整合至Y3菌株基因组上，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
911b
‑
P
TEF1
‑
IDI
‑
T
CYC1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
P
TEF1
‑
ERG20
‑
T
CYC1
‑
P
PGK1
‑
INO2
‑
T
INO2
，命名为酿酒酵母Y4；
[0014](5)将P
TDH3
‑
PDR5
‑
T
TDH3
片段整合至Y4菌株基因组上，构建得到酿酒酵母菌株BY4741ΔROX1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
911b
‑
P
TEF1
‑
IDI
‑
T
CYC1
‑
P
GPD
‑
tHMG1
‑
T
ADH1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母强化表达了3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子的相关基因INO2、Pdr5蛋白和Osh3蛋白；并且敲除了ROX1基因。2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过P
GPD
启动子强化表达tHMG1，通过P
PGK1
启动子强化表达INO2，通过P
TEF1
启动子强化表达ERG20和IDI，通过P
TDH3
启动子强化表达Pdr5，通过P
TEF2
启动子强化表达Osh3。3.如权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母BY 4741为出发菌株。4.如权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述tHMG1的Gene ID为42650、所述IDI的Gene ID为855986、所述ERG20的Gene ID为853272、所述INO2的Gene ID为851701、所述ROX1的Gene ID为856178、所述Pdr5蛋白的Gene ID为854324、所述Osh3蛋白的Gene ID为856472。5.一种制备角鲨烯的方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，刘家恒，金柯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：