一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法技术

本发明专利技术提供了一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法，所述重组毕赤酵母工程菌命名为FHX

【技术实现步骤摘要】
一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构建方法


[0001]本专利技术涉及一种含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌及构 建方法，该重组毕赤酵母工程菌同时具有高拷贝高表达的特征。
技术背景
[0002]溶菌酶首次于1922年被英国的细菌学家佛莱明发现，直到1937年，Abraham 与Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体，人们才开始对溶菌酶进行研究。1965 年，Blake等人用x射线晶体结构分析法阐明了鸡蛋白溶菌酶的三维结构,证实 了溶菌酶含有4对二硫键，其分子近椭圆形。研究还发现溶菌酶的内部几乎全部 为非极性，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，并发现在溶菌 酶分子的表面有一个裂缝，该裂缝的大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，即为 溶菌酶的活性部位。2001年，Vavid等人证实了NAM和NAG之间的β
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1，4
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糖苷 键的水解是通过一个双置换反应完成的。溶菌酶能水解肽聚糖中的N一乙酰葡萄 糖和N一乙酰胞壁酸之间的β
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1，4糖苷键，以此破坏细菌的细胞壁，具有较强 的抑菌抗菌活性。溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和 动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。在人体内，溶菌酶 分布相当广泛，主要存在于体液、细胞和组织器官中。报道的主要有眼泪、唾液、 鼻涕、汗液、尿液、血清、胸水、淋巴液、脑脊液体液中，白细胞、巨噬细胞、 单核细胞中，组织器官有心、肺、肝、脾、肾、胎盘，其中在肾和肺中含量最高。
[0003]1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布：溶菌酶应用于食品工业中是安全的， 我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。溶菌酶的化学 本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收。因此不会在体内残留， 无毒性，安全性很高，在药品、饲料和食品等行业具有广泛的应用前景。在食品 工业中可应用于水产品、乳制品、果蔬、肉类、酒及饮料的防腐保鲜。在畜牧业 溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在医学上溶菌酶可以代替抗生素作为抗菌消 炎的药物。
[0004]如今抗生素耐药问题日趋严重，寻找抗生素物质的补充或可替代产品刻不容 缓，临床上由于抗生素药物的长期使用，致使很多致病菌产生了广泛的耐药性。 因此科研工作人员对原始的抗生素物质进行了各种修饰，得到了很多抗生素药物 的衍生物，然而尽管如此，仍难以弥补抗生素及其衍生物的缺陷。并且作为一种 人体外源药物，某些人群会对抗生素产生过敏反应，而人溶菌酶作为人体自身存 在的一种蛋白，可以很好地弥补这一缺陷。人溶菌酶是一种通过水解细菌细胞壁 中肽聚糖而发生溶菌的胞壁质酶。除了溶菌酶的杀菌，控肿、消炎的作用，溶菌 酶在人体内部环境中还具有改善局部血液循环、组织修复和分解脓液等功效。因 此人溶菌酶药物的应用可直接减少抗生素物质等的使用，具有广阔的市场前景和 重要的商业价值。目前市场上的溶菌酶产品大多以蛋清溶菌酶为主要原料，我国 SFDA已下达13个鸡溶菌酶肠溶片生产文号、16个含片生产文号。除了应用在医 药行业，鸡溶菌酶在日化行业也得到了应用，如口腔护理产品牙膏、漱口液、喷 剂，化妆品等。目前，
溶菌酶主要从鸡蛋清和蛋壳膜中提取。但这种直接提取的 生产方式，其规模小、成本高，不利于大规模化生产与应用。同时，鸡蛋清溶菌 酶对于人体而言是一种异源蛋白，在蛋白质一级结构上与人溶菌酶有较大差异， 因此，它具有明显的局限性。鸡溶菌酶用于过敏体质人群时，可引发过敏反应， 严重者可导致死亡。另外，鸡溶菌酶在人体内会产生免疫原性与毒副作用，无法 用于静脉用药。由于鸡溶菌酶的局限性，人们开始更加关注人溶菌酶的研究和开 发。
[0005]人源溶菌酶相对于鸡溶菌酶在医药行业有明显的优势，利用基因工程技术构 建溶菌酶外源表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶 菌酶生产技术研究的热点。早期的专利号为ZL01132373.6的中国专利以pPIC9 框架表达人源溶菌酶，但pPIC9没有Kan抗性基因，没法进行多拷贝转化子的筛 选，这样难以得到高表达人源溶菌酶的毕赤酵母菌株，后面也有多个研究表达人 源溶菌酶，但建立高表达的人源溶菌酶菌株一直是科研和工业界的目标，因为高 表达意味着相对的低成本，在溶菌酶发酵生产应用上十分重要。
[0006]本专利技术构建了一种重组毕赤酵母菌株能表达天然N端人源溶菌酶成熟肽。重 组毕赤酵母菌株能高表达人源溶菌酶，这将有利于我国溶菌酶蛋白的大规模工业 化生产，有较大经济效益和社会效益。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及构 建方法，实现发酵法高效生产人源溶菌酶。
[0008]本专利技术构建了含高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，并进 行了相应的发酵试验。根据本专利技术的第一方面，本专利技术采用的技术方案是：
[0009]一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，命名为FHX
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LYC71， 按相关标准保存重组菌株于
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80℃低温冰箱中。其保藏机构为：中国典型培养物保 藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181，保藏时间为2021年2月4日，中国典型培 养物保藏中心的地址是湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编430072。分类命 名为Pichia sp.。
[0010]本专利技术的高拷贝人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕 赤酵母工程菌是将人工合成序列SEQ ID NO.1以BamHI和EcoRI位点装载于pPIC9K 以上，构建pPIC9K
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LYC71，以SalI线性化上pPIC9K
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LYC71后，以高拷贝数整合 毕赤酵母基因组而获得，所述高拷贝是指人溶菌酶基因的拷贝数为大于等于8。 所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，所述的毕赤酵母工程菌命名 为重组毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)FHX
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LYC71。所涉及人溶菌酶基因编码 蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，对应人源溶菌酶(NCBI数据库登入号GenBankProtein ID：NP_000230)的成熟肽。
[0011]根据本专利技术的上述技术方案，本专利技术利用pPIC9K载体，构建了一种含高拷贝 人源溶菌酶基因的高表达重组毕赤酵母工程菌，其具体特点说明如下：
[0012]在针对人源溶菌酶一些专利中，经常利用XhoI、EcoRI位点在Ppic9载体上 进行构建，但pPIC9没有Kan抗性基因，没法进行多拷贝转化子的筛选，这样难 以得到高表达人源溶菌酶的毕赤酵母菌株。因为在pPIC9K有两个XhoI位点，分 别位于1193和5710位，故该方法不便在pPIC9K上进行操作。而若利用pPIC9K 框架上的多克隆位点SnaBI、EcoRI、AvrII和
NotI插入编码人溶菌酶的DNA都 会不可避免的在合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，命名为FHX
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LYC71；其保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2021181。2.一种整合高拷贝人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示人工合成序列中所涉及特有的编码人源溶菌酶基因序列装载于pPIC9K载体，而不是pPIC9载体。3.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。4.如权利要求2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于SEQ ID NO.1序列中以BamH I和EcoR I位点装载于pPIC9K载体上，再整合于毕赤酵母基因组。5.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于该重组毕赤酵母工程菌能在4.0mg/mL遗传霉素(G418)的YPD平板上生长。6.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于经定量PCR分析表明该重组毕赤酵母工程菌人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8。7.如权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法包括以下步骤：1)将SEQ ID NO.1所示人工合成序列以BamH I和EcoR I位点装载于分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K
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LYC71；2)将重组质粒pPIC9K
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LYC71用Sal I单酶切，在His4位点进行线性化,然化将上述线性化质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将转化的毕赤酵母GS115感受态细胞涂布于MD平板，培养后，挑取MD平板上的His+转化子500个,然后经在MD和MM平板筛选，挑选MD和MM平板均生长均良好的克隆即Mut+表型200个；3)将200个Mut+表型转化子接种于在浓度为2.0，3.0,4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上，筛选多拷贝转化子；4)上面筛选得到多拷贝转化子，先经PCR验证，然后经定量PCR分析，挑选在4.0mg/mL遗传霉素G418的YPD平板上生长，经定量PCR分析验证人溶菌酶基因的拷贝数在该重组毕赤酵母工程菌为大于等于8的20个转化子；5)将步骤4)挑选的转化子进行小量表达溶菌酶试验，然后挑选其中高表达的5株，进行摇瓶诱导表达实验，6)将上面挑选的5...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻恒锋，喻致远，曹立环，周正，龚文伟，
申请(专利权)人：义乌市欧雅化妆品有限公司，
类型：发明
国别省市：