一种酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和生物能源技术领域，具体涉及一种酵母工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术提供一种酵母工程菌，其表达木质素多功能过氧化物酶和/或锰过氧化物酶。该菌株可利用木质素降解产物为碳源进行生长、合成并积累微生物油脂，能够实现木质素生物质原料向油脂的高效转化，为木质纤维素生物质原料的全资源利用及高效转化提供核心技术，具有广泛的工业应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酵母工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和生物能源
，具体涉及一种酵母工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]油脂是人类生活不可或缺的重要大宗产品，可替代化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料。近年来，全球油脂需求量日益增加，导致油脂资源紧张、价格波动较大。微生物油脂是产油微生物在特定条件下合成的胞内产物，因其生产不受气候、季节和场地的限制而备受关注。以廉价且丰富的木质纤维素类生物质资源为原料的脂质生物炼制研究近年来受到高度关注，被认为是具有潜力的油脂生产新途径。
[0003]木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，主要由纤维素(40
‑
50％)、半纤维素(25
‑
35％)和木质素(15
‑
20％)三大部分构成，木质纤维素类生物质如稻草、小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣等的年产量较高，存在巨大的开发利用空间，生物转化是重要的转化方式之一。其中，纤维素和半纤维素可在复合糖苷酶的作用下得到可被微生物直接利用的混合糖溶液。由于木质纤维素的三大组成相互交织形成致密的网状结构，导致其有效利用一般需要经过原料预处理(结构解聚，暴露纤维素和半纤维素)、酶水解(纤维素和半纤维素被水解成单糖或寡糖)和产物发酵(微生物转化糖进行产物合成)三大步骤，实现将木质纤维素转化为油脂或其它高值化学品，主要集中于纤维素与半纤维素的转化利用。
[0004]木质素是可再生芳香族化合物，不但不可被产油微生物转化利用，还会在极端的原料预处理过程(高温高压、强酸强碱)，释放较多对后续酶解和微生物发酵有抑制作用的木质素降解产物，如小分子木质素基酚类化合物、有机酸等。特别是为提高产品产率，通常会将木质纤维素水解液浓缩以增加发酵液中糖浓度，导致木质纤维素水解液中的木质素降解产物浓度相应增大，这些高浓度的木质素降解产物严重抑制了产油微生物的生长代谢及油脂合成。因此，如何解除木质纤维素素水解过程产生的木质素降解产物对产油微生物的生长和油脂合成的抑制，进一步实现木质素降解产物的生物转化，是木质纤维素类生物质向油脂高效转化亟待解决的瓶颈问题。
[0005]产油酵母可转化生物质资源合成油脂及脂质代谢产品，对生物质能源和先进生物制造具有重要意义，受到广泛关注。天然的产油酵母不可以生物转化木质素降解产物，对木质素降解产物耐受性低。目前尚没有使用代谢工程改造的方法来实现产油酵母对木质素降解产物的生物转化，以提高产油酵母对木质素降解产物耐受性的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是提供一种可转化木质素降解产物的酵母工程菌。
[0007]本专利技术的第二目的是提供该酵母工程菌的构建方法。
[0008]本专利技术的第三目的是提供该酵母工程菌的应用。
[0009]本专利技术的第四目的是提供利用该酵母工程菌生产微生物油脂的方法。
ID NO.5所示序列的第6068
‑
7569位，T
HSP
终止子的序列为SEQ ID NO.5所示序列的第9783
‑
10222位。
[0027]上述启动子、终止子可通过以酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得或通过人工基因合成获得。
[0028]上述表达盒能够使得木质素多功能过氧化物酶、锰过氧化物酶在酵母中高效、适配性地表达，有利于提高酵母利用木质素降解产物进行生长和合成油脂的能力。
[0029]对于将上述两种酶整合至酵母染色体的方法，可采用本领域常规的酵母基因工程方法，例如：利用酵母整合型载体，使用非同源末端连接或同源重组的方法在染色体上整合目标基因。
[0030]本专利技术中，所述酵母工程菌的出发菌株为本身不表达木质素多功能过氧化物酶、锰过氧化物酶，用于作为受体菌体导入木质素多功能过氧化物酶、锰过氧化物酶的编码基因的酵母菌株。优选为能够利用生物质资源合成并积累油脂、脂质代谢产物的产油酵母菌，可选自属于油脂酵母属(Lipomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、隐球酵母属(Cryptococcus)、冬孢酵母属(Rhodosporidium)或红酵母属(Rhodotorula)的任一菌株。
[0031]作为本专利技术的一种实施方式，所述酵母工程菌的出发菌株为选自保藏编号为CGMCC No.2.1389的圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、保藏编号为GDMCC No.2.224的圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)单倍体NP11、保藏编号为CGMCC No.2.571的皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、保藏编号为NRRL Y
‑
11557的斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、保藏编号为ATCC 204091的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、保藏编号为ATCC 20509的弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)中的任意一种。
[0032]上述出发菌株在整合木质素多功能过氧化物酶、锰过氧化物酶的表达盒后，其利用木质素的能力均得到十分显著的提升，能够利用木质纤维素类生物质高效生长和积累油脂。
[0033]优选地，所述酵母工程菌的染色体上含有3个拷贝的木质素多功能过氧化物酶表达盒，或者，含有2个拷贝的锰过氧化物酶表达盒。
[0034]作为本专利技术的一种优选实施方式，3个拷贝的木质素多功能过氧化物酶表达盒的染色体插入位点分别为：圆红冬孢酵母的Scaffold 14的366954bp处的非编码区插入2个表达盒，且2个表达盒顺次相连，Scaffold 22的317063bp处的非编码区插入1个表达盒。2个拷贝的锰过氧化物酶表达盒的染色体插入位点分别为：Scaffold 46的40034bp处、自噬蛋白基因(ATG4)内含子区插入1个表达盒，Scaffold 1的58108bp、假定蛋白RHTO_00026外显子区插入1个表达盒。
[0035]具有上述染色体整合拷贝数和整合位置的酵母工程菌，其利用木质素的能力的提升效果更优，能够利用木质纤维素类生物质高效生长并合成油脂，尤其对于保藏编号为GDMCC No.2.224的圆红冬孢酵母单倍体NP11效果更优。
[0036]第二方面，本专利技术提供所述酵母工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：将木质素多功能过氧化物酶表达盒和/或锰过氧化物酶表达盒导入出发菌株中，经筛选获得表达木质素多功能过氧化物酶和/或锰过氧化物酶的菌株。
[0037]以上所述的方法中，将木质素多功能过氧化物酶表达盒和/或锰过氧化物酶表达
盒导入出发菌株中可采用本领域常规的基因工程手段。
[0038]具体地，将所述表达盒连接至酵母游离型载体或整合型载体，将所述游离型载体或整合型载体导入所述出发菌株中。
[0039]作为本专利技术的一种实施方式，将木质素多功能过氧化物酶VP基因、锰过氧化物酶MNP基因分别连接于载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母工程菌，其特征在于，其表达木质素多功能过氧化物酶和/或锰过氧化物酶；所述酵母工程菌属于油脂酵母属(Lipomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、隐球酵母属(Cryptococcus)、冬孢酵母属(Rhodosporidium)或红酵母属(Rhodotorula)。2.根据权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述木质素多功能过氧化物酶来源于杏鲍菇(Pleurotus eryngii)，和/或，所述锰过氧化物酶来源于黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。3.根据权利要求2所述的酵母工程菌，其特征在于，所述木质素多功能过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，和/或，所述锰过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述木质素多功能过氧化物酶的编码基因的序列如SEQ ID NO.3所示，和/或，所述锰过氧化物酶的编码基因的序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1～3任一项所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌的染色体上含有选自木质素多功能过氧化物酶表达盒、锰过氧化物酶表达盒中的一种或两种；优选地，所述木质素多功能过氧化物酶表达盒含有Ppgk启动子、木质素多功能过氧化物酶编码基因VP和转录终止子；所述锰过氧化物酶表达盒含有Ppgk启动子、锰过氧化物酶编码基因MNP和转录终止子；更优选地，所述转录终止子为T
HSP
。5.根据权利要求1～4任一项所述的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌的出发菌株为选自保藏编号为CGMCC No.2.1389的圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、保藏编号为GDMCC No...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛闯，黄其田，吕力婷，程驰，吴又多，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：