生产汉黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及生产汉黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。通过基因重组技术在酵母工程菌中引入了外源基因，获得可生产汉黄芩素的酵母工程菌，其以白杨素作为前体生产汉黄芩素类化合物。所述酵母工程菌具有代谢背景低、异源表达能力强，可全细胞合成终产物以及终产物易分离等特征，为工业化生产黄酮类药物提供了新思路。类药物提供了新思路。

【技术实现步骤摘要】
生产汉黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用
[0001]本申请是申请号为202010263807.X、申请日为2020年4月7日的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及生产汉黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。

技术介绍

[0003]黄酮类化合物广泛存在于高等植物及蕨类植物中，属于植物的次生代谢产物，是很多传统中草药植物的重要的活性成分。黄酮类化合物由于其结构的特殊性及多样性因而具有多种多样的生物学功能：治疗心脑血管系统疾病，降血脂、降胆固醇、抑制血栓和扩张冠状动脉的作用；提高甲状腺对雌激素的敏感性，使甲状腺C细胞分泌降钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；清除代谢过程中过量的自由基，保护肝细胞免受自由基亲电子化合物和毒物的损害；抑制自由基的生成、降低脂质过氧化和刺激抗氧化酶的作用等。
[0004]黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物，中国人以黄芩根部入药已有两千多年的历史，其中药理活性最为显著的主要是根部特有的黄芩素类黄酮分子。此类根部特异性黄酮在结构上有别于其他黄酮，主要表现为B环上4
’‑
OH的缺失。除了较为传统的抗炎、抗病毒、抗氧化作用等，在癌症、帕金森症、阿兹海默症等严重病症的治疗中黄芩素类黄酮分子也能起到积极作用。如黄芩素可通过下调抗凋亡的Mcl
‑
1蛋白来诱导胰腺癌细胞凋亡以达到抗癌效果，同时还能抑制α<br/>‑
核蛋白的纤维形成以对抗帕金森症；黄芩苷能保护神经元细胞免受淀粉样β蛋白诱导的氧化应激以辅助预防阿兹海默症，有选择性地通过调节信号分子以阻滞人肺癌细胞的增殖；汉黄芩素可调控恶性肿瘤与正常淋巴细胞的氧化还原状态以达到区别肿瘤细胞的效果等。目前，多种上市药物中含有黄芩素、黄芩苷成分，如黄芩素铝胶囊、黄芩苷胶囊、熊胆黄芩滴眼液等。
[0005]黄酮类化合物最常见的制备方法为直接通过物理或化学手段从植物中提取。植物提取法较为直接且操作简单，但对植物原材料及有机试剂的大量消耗会使该法不仅深受气候及地域因素限制，同时对人体和环境也造成损害。化学合成法涉及的反应剧烈，存在安全隐患，应用前景有限。目前生物法从头合成黄芩素等黄芩根部特异性黄酮的案例较少，且明显受到异源表达植物酶活较低的限制，黄酮产量低，提升空间有限，无法实现进一步的产业化应用。
[0006]原核生物大肠杆菌已被应用于异源合成一些化合物，但是本专利技术人针对黄芩素类化合物的研究中发现，植物酶与大肠杆菌的适配性较低，大肠杆菌中一些植物酶的表达不理想，难以运用黄芩这一物种来源的一些合成酶类在大肠杆菌中进行黄芩素类化合物的生产。一些反应所需的酶在大肠杆菌中表达时常无活性或低活性，需要大量的表达优化设计
如增加融合标签促进正确折叠等，但即便如此，也常常效果欠佳。例如，黄芩素类化合物生产中会引入细胞色素P450家族的酶，其在大肠杆菌难以表达或者必需经复杂改造才可能发挥部分活性。利用大肠杆菌工程菌株合成黄芩素的过程中，需人工添加L
‑
苯丙氨酸前体才能合成，且合成效率低。此外，大肠杆菌的内毒素潜在地会导致药物纯化工艺的难度和要求更高。
[0007]现有技术中，酵母细胞表达化合物方面，尽管也有一些探索，但是本领域此前尚未成功运用酵母细胞来合成黄芩素类化合物，尤其是毕赤酵母细胞。这可能在于表达此类化合物需要引入较多基因，部分基因编码的蛋白本身的催化活性不高，需要高表达才能满足合成能力需求，而外源基因剂量过高导致酵母细胞的一系列生理问题。例如，外源基因过多而存在不稳定问题；蛋白折叠胁迫对于生理造成不利影响；蛋白质过量表达会消耗宿主细胞的碳源和能源，会给宿主带来一定的代谢负担。，尽管毕赤酵母已经被应用于较多种外源基因的表达，但是运用其进行多种外源基因的稳定共表达、并且实现高效生产在本领域中仍然存在瓶颈。
[0008]因此，本领域亟待进一步地研究和开发黄芩素等黄芩根部特异性黄酮的新型底盘宿主和生产工艺，以期获得高效表达，且能够在工艺方面简化操作、降低成本。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供生产黄芩素类化合物的基因工程酵母菌、其构建方法及应用。本专利技术的技术方案是目前唯一全细胞可由基础碳源从头合成黄芩苷的技术方案。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供一种生产黄芩素的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS
‑
2，CHI，FNSII
‑
2，CPR1，F6H；和(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生产黄芩素。
[0011]在本专利技术的第二方面，提供一种生产黄芩苷的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：PAL，4CL，CHS
‑
2，CHI，FNSII
‑
2，CPR1，F6H，UBGT的表达盒；和(2)培养(1)的酵母工程菌，从而生产黄芩苷。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供一种生产汉黄芩素的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：F8H，PFOMT5；和(2)培养(1)的酵母工程菌，并加入白杨素作为前体，生产汉黄芩素。
[0013]在另一优选例中，所述4CL、CHS
‑
2、CHI、FNSII
‑
2、F6H、UBGT、F8H、PFOMT5来自于黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi，Sb)。
[0014]在另一优选例中，所述PAL来自于圆红酵母(Rhodotorula toruloides；Rt)。
[0015]在另一优选例中，所述CPR1来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana；At)。
[0016]在另一优选例中，所述的酵母工程菌为毕赤酵母；较佳地，在所述酵母工程菌中转化PAL、4CL、CHS
‑
2、CHI、FNSII
‑
2、CPR1、F6H时，制备PAL+4CL的基因片段、CHS
‑
2+CHI+FNSII
‑
2的基因片段、F6H+CPR1的基因片段，引入酵母工程菌。
[0017]在另一优选例中，在将UBGT引入酵母工程菌时，设置UBGT+ENO1的基因片段；所述ENO1为一段基因片段，有助于为UBGT提供整合位点。较佳地，所述ENO1可由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32序列的引物扩增获得。
[0018]在另一优选例中，该毕赤酵母中KU70基因功能被下调或缺失。
[0019]在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，步骤(2)中利用酵母培养基进行培养，较佳地培养期间补加碳源。
[0020]在另一优选例中，生产黄芩素或黄芩苷时，所述碳源为葡萄糖；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产汉黄芩素的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中转化有外源的下组基因的表达盒：F8H，PFOMT5；和(2)培养(1)的酵母工程菌，并加入白杨素作为前体，生产汉黄芩素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述F8H和/或PFOMT5来自于黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi，Sb)。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母工程菌为毕赤酵母。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该毕赤酵母中KU70基因功能被下调或缺失。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用酵母培养基进行培养，培养期间补加碳源。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖；更佳地每隔12～36小时添加1次葡萄糖，添加至终浓度1～4％(v/v)；较佳地...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡孟浩，钱芷兰，陈鑫洁，赵清，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：