一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。本方法经过食品级安全菌株毕赤酵母异源整合表达了硫酸软骨素裂解酶ABCI，可实现胞内和胞外两种生产模式，且培养过程无需添加任何抗生素。通过对于启动子的筛选，得到了能够有效提高硫酸软骨素裂解酶ABCI酶活表达量的启动子，使得重组毕赤酵母在发酵罐条件下，分泌表达酶活可达到2840U/L，为食品级微生物高效生产制备硫酸软骨素裂解酶奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。适合于工业化生产应用。适合于工业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是一种由D
‑
葡萄糖醛酸和N
‑
乙酰半乳糖胺交替连接而成的线性多糖，其分子量在7
‑
50kDa之间，主要以蛋白聚糖的形式广泛分布在软骨组织中。CS有着重要的生物学功能。其骨架硫酸软骨素是软骨素经过硫酸转移酶的硫酸化修饰所形成的，根据硫酸化修饰位置的不同，硫酸软骨素可以被分为以下四种类型：CSA(4
‑
O
‑
硫酸化)、CSC(6
‑
O
‑
硫酸化)、CSD(2,6
‑
di
‑
O
‑
硫酸化)和CSE(4,6
‑
di
‑
O
‑
硫酸化)。由于CS有着优良的生物相容性，其应用范围非常广泛，例如医疗健康，保健品，食品及化妆品领域。不同分子量的硫酸软骨素其应用范围与功能效果也存在差异。近年来有实验证明分子量在3500
‑
5300Da的硫酸软骨素，其药理活性最强，对防治风湿性炎症以及伤口愈合等具有更好的疗效。因此，制备低分子量的硫酸软骨素是非常有必要的。
[0003]目前，低分子量的硫酸软骨素制备方法主要有：(1)酸降解法，酸降解是指将硫酸软骨素溶解于酸溶液(如乙酸、盐酸)在一定的温度下进行降解，酸降解反应比较剧烈会导致硫酸根脱落，而且寡糖的自由基清除的能力也会降低；(2)过氧化氢降解法，该方法是采用过氧化氢的氧化作用降解硫酸软骨素，优点是产物无毒，不需要特殊的后处理，对双糖的结构破坏比较小；(3)酶解法，酶解法是指采用硫酸软骨素酶或透明质酸酶等可降解软骨素的酶对硫酸软骨素进行酶解获得寡糖。其中，酶解法因条件温和、专一性强，是一种非常有前景的制备低分子量硫酸软骨素的方法。
[0004]硫酸软骨素裂解酶(Chondroitinase)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和寡聚糖的裂解酶。根据底物谱的差异，将硫酸软骨素裂解酶主要分为三类：硫酸软骨素裂解酶AC(EC 4.2.2.5)、硫酸软骨素裂解酶B(EC 4.2.2.19)、硫酸软骨素裂解酶ABC(EC 4.2.2.20)。其中，硫酸软骨素裂解酶AC能够降解CSA及CSC，但是不能降解硫酸皮肤素(DS)结构；硫酸软骨素裂解酶B能特异性降解DS结构，但不能降解CSA、CSC；硫酸软骨素裂解酶ABC具有较宽的底物谱，能够降解CSA、CSC、DS等多种CS结构。根据切割方式的不同，硫酸软骨素裂解酶ABC又分为内切模式的硫酸软骨素裂解酶ABCI及外切模式的硫酸软骨素裂解酶ABCII，硫酸软骨素裂解酶ABCI能够随机断裂CSA结构，终产物为二糖和四糖的混合物，四糖居多；硫酸软骨素裂解酶ABCII从非还原端开始断裂CSA结构，终产物为二糖。
[0005]但目前硫酸软骨素裂解酶多用大肠杆菌进行表达，而由此制备得到的硫酸软骨素的安全性无法得到保证，限制了其在诸多领域的应用。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的食品级安全酵母菌及其应用。本专利技术利用食品级安全菌株毕赤酵母实现了硫酸软骨素裂解酶ABCI的胞内表达及分泌表达，为制备食品级硫酸软骨素寡糖提供了可能。
[0007]本专利技术提供了一种重组毕赤酵母，所述毕赤酵母中表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码硫酸软骨素裂解酶ABCI的基因。
[0008]在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以SEQ ID NO.2所示的序列为启动子，启动编码所述硫酸软骨素裂解酶ABCI的基因的表达。
[0009]在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母菌以Pichia pastorisGS115，或Pichia pastorisKM71，或Pichia pastorisX33，或Pichia pastorisSMD1168为出发菌株。
[0010]在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母的表达载体包括但不限于pGAPZ系列和pGAPZα系列质粒。
[0011]在一种实施方式中，利用pGAPZ系列质粒实现硫酸软骨素裂解酶ABCI的胞内表达，利用pGAPZα系列质粒实现胞外表达。
[0012]本专利技术提供了一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的方法，利用所述重组毕赤酵母为发酵菌株，发酵生产硫酸软骨素裂解酶ABCI。
[0013]在一种实施方式中，将所述重组酵母单菌落接种至YPD培养基，28～35℃、200～220rpm培养14～18h得到种子液，然后将种子液按培养基体积的5～10％添加至YPD培养基中，在28～35℃、200～220rpm下培养不少于24h；
[0014]或者，将所述重组毕赤酵母接种到含有YPD培养基中，28～35℃、200～220rpm培养18～24h，然后按5～10％转接至含有BSM培养基的发酵罐中发酵培养，在28～35℃，pH为4～6下发酵，控制溶氧大于30％，培养不少于72h。
[0015]在一种实施方式中，将菌株在发酵罐中培养至OD
600
大于50时，按照5～25mL/h流加质量体积比为40～50％的甘油。
[0016]本专利技术提供了所述重组毕赤酵母在生产硫酸软骨素裂解酶ABCI中的应用。
[0017]本专利技术提供了所述重组毕赤酵母在制备包含硫酸软骨素二糖及其衍生物或硫酸软骨素四糖及其衍生物的产品中的应用。
[0018][有益效果][0019]本专利技术首次在食品级安全菌株毕赤酵母中异源表达硫酸软骨素裂解酶，具有较大的应用优势。首先，本专利技术过程中使用的宿主为食、品级，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险；其次，本专利技术实现了硫酸软骨素的胞内表达及分泌表达两种方式，可用于不同的应用场景；本专利技术在毕赤酵母中首次实现了硫酸软骨素裂解酶ABCI的活性表达，通过发酵罐发酵，可使得重组毕赤酵母分泌表达酶活达到2840U/L。
附图说明
[0020]图1为GS115/GAPZαB
‑
ABCI菌株不同时间的酶活。
[0021]图2为启动子突变菌株的相对荧光强度。
[0022]图3为硫酸软骨素裂解酶在3
‑
L发酵罐中不同时间胞外酶活。
[0023]图4为UPLC
‑
MS鉴定硫酸软骨素裂解后的二糖和四糖的质谱图。
具体实施方式
[0024]实施例中涉及的常用方法及序列：
[0025]1、BSM培养基组分为(g/L)：甘油40，K2SO
4 18，MgSO4·
7H2O 14.9，KOH 4.13，85％H3PO
4 26.7mL/L，CaSO4·...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母中表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码硫酸软骨素裂解酶ABCI的基因。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以SEQ ID NO.2所示的序列为启动子，启动编码所述硫酸软骨素裂解酶ABCI的基因的表达。3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌以Pichia pastorisGS115，或Pichia pastorisKM71，或Pichia pastorisX33，或Pichia pastorisSMD1168为出发菌株。4.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母的表达载体包括但不限于pGAPZ系列和pGAPZα系列质粒。5.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母，其特征在于，利用pGAPZ系列质粒实现硫酸软骨素裂解酶ABCI的胞内表达，利用pGAPZα系列质粒实现胞外表达。6.一种生产硫酸软骨素裂解酶ABCI的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一所述重组毕赤酵母为发酵菌株，发酵生产硫酸软骨素裂解酶A...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，金学荣，陈坚，堵国成，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：