一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用制造技术

技术编号:31009693 阅读:16 留言:0更新日期:2021-11-30 00:05
本发明专利技术公开了一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用。本发明专利技术公开的重组酿酒酵母组成型表达β

【技术实现步骤摘要】
一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域,涉及一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用。

技术介绍

[0002]虾青素是类胡萝卜素合成过程中的终级产物,在类胡萝卜素中抗氧化能力最强,被誉为“超级维生素E”。虾青素在藻类和海洋生物中以酯化的形式存在,在细菌和酵母中以游离形式存在。虾青素独特的化学结构,使其可以穿越细胞膜,穿过血脑屏障,因此相对其他类胡萝卜素具有更好的抗脂质氧化能力。由于虾青素能够有效的清除细胞内外的自由基,减少细胞损伤和衰老,因此在对心血管疾病、糖尿病和癌症等疾病方面具有较好的预防和治疗作用。
[0003]目前,虾青素的来源主要有化学合成和生物合成。化学合成虾青素过程复杂,过程中残留较多中间体,缺乏安全性,且合成的虾青素为三种构型的混合物,(3R,3

R)、(3S,3

S)、(3R,3

S)为1:1:2,抗氧化能力差,因此化学合成的虾青素目前只被批准用于水产养殖。生物合成虾青素的天然微生物包括雨生红球藻和红发夫酵母。红发夫酵母生产(3R,3

R)构型的虾青素,其抗氧化能力相对较低,目前主要用于饲料行业,用于改善动物的肉质和颜色,提高动物的免疫力。目前唯一被批准人类食用的是雨生红球藻生产的虾青素,其虾青素含量达到15-30mg/g DCW,在总类胡萝卜素中占99%以上,且雨生红球藻中的虾青素以(3S,3

S)形式存在,生物学活性很高。但是雨生红球藻的培养需要适宜的气候、长时间的光照以及大量的水资源,培养周期较长,导致生产成本较高。因此研究人员将目光转向了遗传背景清楚、基因操作工具丰富的大肠杆菌和酿酒酵母等微生物。虽然采用了大量的代谢工程手段和诱变技术,但是虾青素的产量仍然较低,离工业化生产仍然有不小的距离。因此,平衡虾青素在异源宿主内代谢路径的代谢通量和优化培养条件对提高虾青素生产尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提高酿酒酵母中虾青素的产量和纯度。
[0005]为解决上述技术问题,本专利技术提供一株重组酿酒酵母,其组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW,诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ,将中间产物β-胡萝卜素合成为虾青素,所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的拷贝数之比为3:1-3:2;
[0006]该重组酿酒酵母为生产虾青素的工程菌株,为平衡酿酒酵母中虾青素路径碳源的流动,提高虾青素产量和纯度,得到工程菌株;所述平衡酿酒酵母中虾青素路径碳源的流动,提高虾青素产量和纯度,为通过调整β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的相对拷贝数,然后在不同类型启动子调控下,发酵过程中优选加入诱导剂来诱导CrtZ基因表达的时间和发酵的温度而实现的。
[0007]在一些实施方案中,上述重组酿酒酵母中,所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的拷贝数之比为3:2。
CrtW-TEF2t-Gal1-CrtZ-ADH1t-Gal10-CrtZ-TPI1t中的一种或多种,优选为PRS426-HXT7p-CrtW-CYC1t-TDH3p-CrtW-TDH2t-FBA1p-CrtW-TEF2t-Gal1-CrtZ-ADH1t-Gal10-CrtZ-TPI1t。
[0021]为解决上述技术问题,本专利技术还提供一种构建上述任一所述的重组酿酒酵母的方法,包括将上述任一所述的重组表达载体转入出发酿酒酵母中获得重组酿酒酵母的步骤;
[0022]所述出发酿酒酵母为能合成β-胡萝卜素的酿酒酵母,优选为Scy10026酿酒酵母。
[0023]为解决上述技术问题,本专利技术还提供一种生产虾青素的方法,包括将上述任一所述的重组酿酒酵母进行发酵培养,使得β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW组成型表达并且在发酵培养过程中添加D-(+)-半乳糖诱导β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ表达以合成虾青素的步骤。
[0024]在一些实施方案中,上述生产虾青素的方法中,所述发酵培养包括将上述任一所述的重组酿酒酵母在发酵培养基中进行发酵培养,在发酵的第30-54小时加入终浓度2%的D-(+)-半乳糖,优选为在发酵的第36小时加入终浓度2%的D-(+)-半乳糖;
[0025]发酵培养基为4%葡萄糖的YPD培养基(组成为10g/L酵母膏,20g/L蛋白胨,40g/L葡萄糖,余量为水);
[0026]发酵温度为20℃-30℃,优选20℃;
[0027]初始OD
600
可以为0.1,转速可以为250rpm。
[0028]在一些实施方案中,上述生产虾青素的方法中,在发酵培养之前,还具有将上述任一所述的重组酿酒酵母进行一级种子培养和二级种子培养的步骤;
[0029]所述一级种子培养包括将上述任一所述的重组酿酒酵母接入装有SC-Ura液体培养基的摇瓶中,在例如30℃、250rpm的条件下培养过夜;
[0030]所述二级种子培养包括将一级种子培养得到的一级种子转接至装有SC-Ura液体培养基的摇瓶中,在例如30℃、250rpm的条件下培养至OD
600
=5-6的步骤。
[0031]所述一级种子的接种量为1%-2%。
[0032]为解决上述技术问题,本专利技术还提供上述任一所述的重组酿酒酵母和/或上述任一所述的重组表达载体在生产虾青素中的应用。
[0033]一种生产高纯度虾青素酿酒酵母工程菌株的构建:
[0034]本专利技术的有益效果是:虾青素代谢路径涉及众多基因的调控(如图1所示),特别是其中的CrtW和CrtZ,本专利技术通过调整CrtW和CrtZ之间的相对拷贝数来平衡酿酒酵母中虾青素路径的碳源流动,并且将CrtW和CrtZ基因置于不同类型启动子的调控下,使得CrtW基因组成型表达,CrtZ基因诱导型表达,构建了重组酿酒酵母,同时进一步优化了重组酿酒酵母的发酵条件。本专利技术提高了虾青素的产量和纯度,摇瓶水平的虾青素生产可高达14.70mg/g DCW,虾青素纯度达到了96.69%,具有良好的工业应用前景。
附图说明
[0035]图1为酿酒酵母中虾青素合成路径示意图。
[0036]图2为实施例1构建的不同拷贝CrtW和CrtZ组合片段示意图。
具体实施方式
[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0039]以下结合具体实施例,对本专利技术作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。
[0040]酿酒酵母S228C(Saccharomyces cerevisiae S228C)在文献“Fisk et al.Saccharomyces cerevisiae S288C genome annotation:a wor本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组酿酒酵母,其组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW,诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ,将中间产物β-胡萝卜素合成为虾青素,所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的拷贝数之比为3:1-3:2。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母,其特征在于:所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的拷贝数之比为3:2。3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母,其特征在于:所述组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW所用的组成型启动子为TDH3p、FBA1p和HXT7p中的一种或多种;和/或所述诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ所用的诱导型启动子为Gal1和Gal10中的一种或多种。4.一种酿酒酵母的重组表达载体,包括组成型启动子及其控制下的β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW,以及诱导型启动子及其控制下的β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ,所述β-胡萝卜素酮化酶基因CrtW和β-胡萝卜素羟化酶基因CrtZ的拷贝数之比为3:1-3:2。5.根据权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于:所述组成型启动子为TDH3p、FBA1p和HXT7p中的一种或多种;和/或所述诱导型启动子为Gal1和Gal10中的一种或多种。6.根据权利要求4或5所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体为SEQ ID NO:58所示的PRS426-TDH3p-CrtW-TDH2t-FBA1p-CrtW-TEF2t-Gal1-CrtZ-ADH1t、SEQ ID NO:67所示的PRS426-HXT7p-...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨祖明王竞辉赵文娟单雨瑶吴计划贾子樊黎源
申请(专利权)人:万华化学集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:

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