【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂质修饰的寡核苷酸及其使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2018年7月6日提交的美国临时申请62/694,970号和2019年5月14日提交的美国临时专利申请62/847,916号的优先权,其各自内容通过引用整体合并于此。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的HD080351赠款的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
[0005]本公开一般涉及单细胞条形码化的方法和应用,以及使用包含脂质修饰的寡核苷酸的组合物进行的核苷酸测序的方法。
技术介绍
[0006]单细胞RNA测序已成为对细胞转录变化作图的有力工具。该技术的主要优势是能够测量样品中细胞多样性的能力。所有的单细胞RNA测序方案都具有一个共同的初始步骤,该步骤中将细胞中转录的RNA转换为cDNA。下一步是通过诸如PCR和体外转录(IVT)等方法进行扩增。以测序为最终步骤的后续步骤使基因产物的表达水平得以量化。从单细胞分离并条形码化RNA是单细胞RNA测序中的第一步,也是至关重要的限制步骤。
[0007]最近,结合单细胞RNA测序进行了大规模筛选(使用shRNA或CRISPR进行遗传扰动)以了解复杂的生物学现象。这些具有明显的优点,即可以通过shRNA或CRISPR gRNA序列轻松识别/条形码化样品。遗传扰动技术可以直接与条形码引入耦合(即,通过将polyA+条形码本身添加到gRNA或shRNA中),然而,不涉及遗传操作的化学/药物/患者筛查 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物,包括:(a)第一脂质缀合的DNA寡核苷酸,其包含第一脂质部分、第一杂交区和第一引物区;(b)第二脂质缀合的DNA寡核苷酸,其包含第二杂交区和第二脂质部分,其中第二杂交区是第一杂交区的反向互补序列;和(C)第三DNA寡核苷酸,其包含来自第二引物区域、条形码区域和捕获序列,其中第二引物区域是第一引物区域的反向互补序列。2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质缀合的DNA寡核苷酸从5'至3'方向包含所述第一脂质部分、所述第一杂交区域和所述第一引物区域。3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质缀合的DNA寡核苷酸从3'至5'方向包含所述第一脂质部分、所述第一杂交区域和所述第一引物区域。4.根据权利要求1所述的组合物,其中第二脂质缀合的DNA寡核苷酸从5'至3'方向包含第二杂交区域和第二脂质部分。5.根据权利要求1所述的组合物,其中第二脂质缀合的DNA寡核苷酸从3'至5'方向包含第二杂交区域和第二脂质部分。6.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第三DNA寡核苷酸从5'至3'方向包含第二引物区域、条形码区域和捕获序列。7.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第三DNA寡核苷酸从3'至5'方向包含第二引物区域、条形码区域和捕获序列。8.根据权利要求1所述的组合物,其中第一脂质部分和第二脂质部分包含具有12至28个碳的脂肪酸。9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质部分包含式I的化合物:含式I的化合物:或其生理上可接受的盐,其中n1为5至25,n2为1至25,并且X选自NH、CH2、O和CH
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R,其中R为C12至C28单甘油酯、烯基、烷基、芳基或芳烷基。10.根据权利要求1所述的组合物,其中第二脂质部分包含式II的化合物:或其生理上可接受的盐,其中n1为5至25,n2为0至24,并且X选自NH、CH2、O和CH
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R,其中R为C12至C28单甘油酯、烯
基、烷基、芳基或芳烷基。11.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质部分包含选自木质酸和胆固醇的脂质。12.根据权利要求1所述的组合物,其中第二脂质部分包含选自棕榈酸和胆固醇的脂质。13.根据权利要求10或11所述的组合物,其中所述胆固醇是胆固醇
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三甘醇(TEG)。14.根据权利要求1所述的组合物,其中所述捕获序列是聚腺苷酸化区。15.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质缀合的DNA寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1(GTAACGATCCAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG)的核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列。16.根据权利要求1所述的组合物,其中第二脂质缀合的DNA寡核苷酸包含与SEQ ID NO:2(AGTGACAGCTGGATCGTTAC)的核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列。17.根据权利要求1所述的组合物,其中第三DNA寡核苷酸包含与SEQ ID NO:3(CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA)的核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列。18.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一脂质缀合的DNA寡核苷酸、所述第二脂质缀合的DNA寡核苷酸和所述第三脂质缀合的DNA寡核苷酸中的一个或多个与固相支持物结合。19.根据权利要求18所述的组合物,其中,所述固体载体是珠。20.根据权利要求19所述的组合物,其中,所述捕获序列包含聚腺苷酸化区域,并且所述珠包含与所述第三DNA寡核苷酸的聚腺苷酸化区域杂交的poly(T)区域。21.一种组合物,能够包含脂质缀合的DNA寡核苷酸,该脂质缀合的DNA寡核苷酸包含脂质部分、条形码区域和捕获序列。22.一种组合物,包括:(a)第一脂质缀合的DNA寡核苷酸,其包含脂质部分和第一引物区域;和(b)第二DNA寡核苷酸,其包含第二引物区域、条形码区域和捕获序列,其中第二引物区域是第一引物区域的反向互补序列。23.一种膜,其包含权利要求1
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22中任一项的组合物。24.一种细胞,其包含权利要求1
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22中任一项的组合物。25.一种试剂盒,其包含权利要求1
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22中任一项的组合物。26.一种RNA测序的方法,包括使细胞与权利要求1
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22中任一项的组合物接触。27.根据权利要求26所述的方法,其进一步包括将所述细胞中的RNA逆转录成cDNA。28.一种定量样品中至少一个基因的mRNA水平的方法,该方法包括使所述样品与权利要求1
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22中任一项的组合物接触。29.根据权利要求28所述的方法,其进一步包括将所述细胞中的RNA逆转录成cDNA。30.根据权利要求29所述的方法,其进一步包括扩增cDNA。31.根据权利要求30所述的方法,其中所述扩增包括PCR或体外转录(IVT)。32.根据权利要求28
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31中任一项所述的方法,其中所述方法在包括至少一个表面的多重的固体支持物中进行,所述至少一个表面具有多个容器,每个容器可从所述固体支持物
外部的点寻址。33.根据权利要求32所述的方法,其中,至少一个容器被配置为在所述容器内生长单个细胞,或者所述容器被配置为使得单个细胞可以从容器内或容器附近的表面悬浮。34.根据权利要求28
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33中任一项所述的方法,其中所述样品是分离的单细胞、细胞器或膜封闭的载体。35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述细胞是真核细胞。36.根据权利要求35所述的方法,其中,所述真核细胞是人细胞或哺乳动物细胞。37.根据权利要求35或36所述的方法,其中所述细胞是转化细胞、原代细胞或过度增殖细胞。38.一种定量样品中mRNA水平的方法,该方法包括:(a)将来自样品的两个或更多个单细胞添加到包含至少一个表面的固体支持物上的两个或更多个容器中,其中每个容器包含来自样品的单个细胞并且可从固体支持物外部的点寻址;和(b)使每个单个细胞与权利要求1
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16中任一项的组合物接触,使得每个细胞包含所述组合物,并且每个细胞是可独立寻址的,以测量至少两个细胞之间的mRNA水平的差异。39.根据权利要求38所述的方法,其进一步包括将细胞中的RNA逆转录成cDNA。40.根据权利要求38所述的方法,其进一步包括扩增cDNA。41.根据权利要求38所述的方法,其中所述固体支持物是96、182、384、1536或3456孔细胞培养板。42.一种确定化合物毒性的方法,所述方法包括使一种或多种化合物与包含权利要求1
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22中任一项的组合物的一个或多个细胞接触。43.根据权利要求42所述的方法,其进一步包括在执行所述接触步骤之后测量所述基因在所述一个或多个细胞中的表达,并且将与所述化合物接触的所述一个或多个细胞中所述基因的表达水平与未接触所述化合物的细胞中所述基因的表达水平进行比较。44.根据权利要求44所述的方法,其中所述基因与细胞死亡或细胞凋亡相关。45.一种诊断受试者疾病的方法,该方法包括测量从该受试者获得的样品中标志物基因的表达,其中所述测量包括使样品与权利要求1
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22中任一项的组合物接触,并且其中标志物基因的表达从预定水平增加或减少表明该受试者患有该疾病。46.根据权利要求45所述的方法,其中,所述测量还包括将所述细胞中的RNA逆转录成cDNA。47.根据权利要求46所述的方法,其中,所述测量还包括扩增所述cDNA。48.根据权利要求47所述的方法,其中所述扩增包括PCR或体外转录(IVT)。49.一种定量样品中经修饰细胞数量的方法,该方法包括使样品与权利要求1
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22中任一项的组合物接触。50.根据权利要求49所述的方法,其中所述修饰的细胞是真核细胞。51.根据权利要求50所述的方法,其中所述真核细胞是人细胞或哺乳动物细胞。52.根据权利要求50或51所述的方法,其中所述修饰的细胞是转化细胞、原代细胞或过度增殖的细胞。53.根据权利要求49所述的方法,其进一步包括使所述样品与对所述第一或第二脂质
缀合的DNA寡核苷酸特异的探针接触。54.根据权利要求53所述的方法,其进一步包括定量所述样品中的探针的量。55.一种确定细胞表达模式的方法,该方法包括:(a)使细胞与化合物接触;和(b)与来自尚未与化合物接触的等效细胞的一个或多个基因的表达相比,测量来自该细胞的一个或多个基因的表达,其中该测量包括使该细胞与权利要求1
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20中任一项所述组合物接触。56.一种标记细胞的方法,从单个细胞中分离内源DNA的方法,或付单个细胞中的核酸序列测序的方法,其包括:(a)使细胞暴露于本文公开的一种或多种锚脂质修饰的寡核苷酸,或权利要求1
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20中任一项的组合物一段时间,该时间足以使锚脂质修饰的寡核苷酸自身嵌入所述细胞的细胞膜内;(b)将细胞暴露于与锚脂质修饰的寡核苷酸互补的一种或多种标记寡核苷酸一段足以使锚脂质修饰的寡核苷酸与一种或多种标记寡核苷酸形成核酸互补链的时间;(c)将一种或多种标记寡核苷酸与一种或多种锚脂质修饰的寡核苷酸连接;以及可选地(d)通过检测与一种或多种标记寡核苷酸相对应的多个独特核苷酸序列之一来检测一种或多种标记寡核苷酸的存在;和/或(e)基于一种或多种标记寡核苷酸的存在分离细胞,其中一种或多种标记寡核苷酸的存在通过检测对应于一种或多种标记寡核苷酸的多个独特核苷酸序列之一来确定。57.根据权利要求56所述的方法,其中所述细胞膜是从细胞外的点将细胞质分开的质膜,或者其中所述细胞膜是核膜。58.一种对来自受试者样品的一个或多个细胞的核酸进行测序的方法,其包括:(a)将对应于样品区域的一个或多个细胞划分到容器;(b)用本文公开的寡核苷酸标记对应于样品区域的一个或多个细胞;(c)从一个或多个细胞中分离核酸;和(d)对来自一个或多个细胞的核酸进行测序。59.根据权利要求58所述的方法,其还包括:(e)从所述一个或多个细胞中的每个中编译序列信息。60.根据权利要求58所述的方法,其中,所述编译步骤包括创建与所述样品的区域相对应的所述一个或多个细胞中的每一个的表达谱。61.根据权利要求59至60中任一项所述的方法,其进一步包括将所述核酸的序列信息和/或表达谱测序信息与所述样品内或所述受试者体内的一个或多个细胞的空间位置相关。62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法,其中,所述标记步骤包括:(w)将一个或多个细胞暴露于一种或多种锚脂质修饰的寡核苷酸一段时间,该时间足以使锚脂质修饰的寡核苷酸自身嵌入细胞的细胞膜内;和/或(x)将一个或多个细胞暴露于与锚脂质修饰的寡核苷酸互补的一个或多个标记寡核苷酸一段时间,该时间足以使锚脂质修饰的寡核苷酸形成具有一个或多个标记寡核苷酸的核
酸互补链;和/或;(y)将一种或多种标记寡核苷酸与一种或多种锚脂质修饰的寡核苷酸连接;和,可选地(z)通过检测与一种或多种标记寡核苷酸相对应的多个...
【专利技术属性】
技术研发人员:Z,
申请(专利权)人:加利福尼亚大学董事会,
类型:发明
国别省市:
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