一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种6

【技术实现步骤摘要】
一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体，特别是一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法。

技术介绍

[0002]抗生素的发现和广泛使用解决了感染、结核等一系列问题，已经成为人们治疗细菌感染不可或缺的药物。其中红霉素主要应用于链球菌引起的扁桃体炎、猩红热，肺炎链球菌下呼吸道感染等。6-脱氧赤酮酸内酯B合酶(DEBS)，是一种聚酮合酶，可催化生成大环内酯类抗菌素红霉素A，主要由DEBS 1,2,3三个酶复合体组分构成，每个复合体组分大小约330kDa，以同源二聚体的形式存在；每个复合体组分又由8个以上的单酶构成，因此完整的复合体组分的表达制备十分困难。对DEBS全酶或各复合体组分(DEBS1,2,3)的制备和研究，一方面能极大地加快对红霉素合成机理的理解，为提高红霉素及类似物的生物合成提供新的途径；另一方面也可以为红霉素等抗生素及衍生物的设计和改造提供理论依据及原料，以期解决抗生素抵抗问题。现有制备6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体的技术中，按其方法生产的酶复合体，纯度较差，同等纯度下的产量较低，且酶的构象均一性、大小的均一性(即样本质量)没有保障。因此，现有的技术存在着产量较低、纯度较低以及酶的构象均一性和大小均一性不稳定的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于，提供一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法。本专利技术具有能够有效提升纯度以及能够有效保证酶的构象均一性和大小均一性的特点，在保证酶的质量和纯度的前提下还能够有效提高产量。
[0004]本专利技术的技术方案：一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法，包括以下步骤：
[0005]第一步、对现有6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的基因序列进行优化，得到优化基因序列；
[0006]第二步、蛋白表达，包括以下具体步骤：
[0007]2.1、将优化的基因序列构建至pet21a载体，得到蛋白表达质粒；在超净台中将1-3μL浓度为20-1000ng/μL蛋白表达质粒加入至10-100μL大肠杆菌Bap1感受态细胞中，得到混合液；将混合液进行冰上孵育15-30min，42℃热激30-60s后，再次冰上孵育2-30min，随后加入0.2-1mL已灭菌LB培养基，37℃震荡培养1h，得到震荡培养菌液；取50-300μL震荡培养菌液均匀涂在LB琼脂平板进行孵育，37℃孵育过夜，得到单克隆物；
[0008]2.2、挑取单克隆至1-5mL LB培养基中，37℃震荡培养6-24h，再接种至20-200mL LB培养基，37℃震荡培养过夜，得到培养液；将培养液接种至500mL-10L的SB培养基中进行稀释，稀释后的OD600为0.1，并在37℃温度下震荡培养至OD600＝0.8后,再进行表达培养，得到表达培养液；将表达培养液离心处理，并收集沉淀，得到大肠杆菌沉淀；
[0009]第三步、蛋白纯化；包括以下具体步骤：
[0010]3.1、按比例将大肠杆菌沉淀与裂解缓冲液混合，并采用超声破碎或高压均质机在4℃的温度下破碎细胞；
[0011]3.2、将破碎后的细胞进行离心处理后，收集上清，对上清进行过滤，得到过滤上清；将过滤上清与Ni-NTA或Ni-IDA填料混合进行孵育，得到孵育样本；将孵育样本加入空层析柱，丢弃流穿液，分次加入15-40倍BV的第一清洗缓冲液、5-15倍BV的第二清洗缓冲液、5-15倍BV的第三清洗缓冲液以及4-10倍BV的洗脱液，收集洗脱液；
[0012]3.3、将洗脱液通过脱盐柱或透析去除咪唑，然后通过阴离子交换柱中的离子交换缓冲液进一步纯化后，收集离子交换层析的洗脱峰，并浓缩至3-5mg/ml，得到纯化浓缩液；6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3位于纯化浓缩液中。
[0013]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，所述裂解缓冲液、第一清洗缓冲液、第二清洗缓冲液、第三清洗缓冲液、洗脱液以及离子交换缓冲液中均含有2-戊酮以及10-碳以下的单酮、双酮中的一种或多种。
[0014]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的基因序列进行优化的具体方式为：对现有6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3基因序列进行部分氨基酸位点的密码子优化，在其C端融合“SSVDKLAAALE”linker序列及8x组氨酸标签和Flag标签。
[0015]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，表达培养的具体过程为：加入终浓度为0.1-0.25mM的IPTG，移入16℃的环境中表达22h，得到表达培养液；或者，用SB自诱导培养基并进行发酵罐发酵，在16-20℃的环境中发酵18-26h，得到表达培养液。
[0016]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，裂解缓冲液包括以下组分：20-100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.8-7.6；200-500mM NaCl；2mM MgCl2；2mM DTT；0-20mM Imidazole；20％w/v的Glycerol；1％v/v的Triton；1-10mM 2-戊酮；蛋白酶抑制剂混合片剂，1片/10mL。
[0017]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，对破碎后的细胞进行离心处理时，采用16000rpm、JLA 8.1000的转子在4℃下离心处理1h后，收集上清；
[0018]采用0.45μm滤膜对上清进行过滤，得到过滤上清；
[0019]取1-10mL Ni-NTA填料和过滤上清在4℃温度下孵育1-4h，得到孵育样本。
[0020]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，第一清洗缓冲液包括以下组分：20-100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0-7.8；150-400mM NaCl；2mM MgCl2；5％-50％w/v的Glycerol；0-20mM Imidazole；1-10mM 2-戊酮；蛋白酶抑制剂混合片剂，1片/10mL；
[0021]第二清洗缓冲液包括以下组分：20-100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0-7.8；150-400mM NaCl；2mM MgCl2；5％-50％w/v的Glycerol；20-40mM Imidazole；1-10mM 2-戊酮；
[0022]第三清洗缓冲液包括以下组分：20-100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0-7.8；150-400mM NaCl；2mM MgCl2；5％-50％w/v的Glycerol；40-60mM Imidazole；1-10mM 2-戊酮。
[0023]前述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法中，洗脱液包括以下组分：20-100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.57.0-7.8；150-400mM NaCl；2mM MgCl2；5％-50％w/v的Glycerol；250-500mM Imidazole；1-10mM 2-戊酮。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步、对现有6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的基因序列进行优化，得到优化基因序列；第二步、蛋白表达，包括以下具体步骤：2.1、将优化的基因序列构建至pet21a载体，得到蛋白表达质粒；在超净台中将1-3μL浓度为20-1000ng/μL蛋白表达质粒加入至10-100μL大肠杆菌Bap1感受态细胞中，得到混合液；将混合液进行冰上孵育15-30min，42℃热激30-60s后，再次冰上孵育2-30min，随后加入0.2-1mL已灭菌LB培养基，37℃震荡培养1h，得到震荡培养菌液；取50-300μL震荡培养菌液均匀涂在LB琼脂平板进行孵育，37℃孵育过夜，得到单克隆物；2.2、挑取单克隆至1-5mL LB培养基中，37℃震荡培养6-24h，再接种至20-200mL LB培养基，37℃震荡培养过夜，得到培养液；将培养液接种至500mL-10L的SB培养基中进行稀释，稀释后的OD600为0.1，并在37℃温度下震荡培养至OD600＝0.8后,再进行表达培养，得到表达培养液；将表达培养液离心处理，并收集沉淀，得到大肠杆菌沉淀；第三步、蛋白纯化；包括以下具体步骤：3.1、按比例将大肠杆菌沉淀与裂解缓冲液混合，并采用超声破碎或高压均质机在4℃的温度下破碎细胞；3.2、将破碎后的细胞进行离心处理后，收集上清，对上清进行过滤，得到过滤上清；将过滤上清与Ni-NTA或Ni-IDA填料混合进行孵育，得到孵育样本；将孵育样本加入空层析柱，丢弃流穿液，分次加入15-40倍BV的第一清洗缓冲液、5-15倍BV的第二清洗缓冲液、5-15倍BV的第三清洗缓冲液以及4-10倍BV的洗脱液，收集洗脱液；3.3、将洗脱液通过脱盐柱或透析去除咪唑，然后通过阴离子交换柱中的离子交换缓冲液进一步纯化后，收集离子交换层析的洗脱峰，并浓缩至3-5mg/ml，得到纯化浓缩液；6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3位于纯化浓缩液中。2.根据权利要求1所述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法，其特征在于：所述裂解缓冲液、第一清洗缓冲液、第二清洗缓冲液、第三清洗缓冲液、洗脱液以及离子交换缓冲液均含有2-戊酮以及10-碳以下的单酮、双酮中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法，其特征在于，6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的基因序列进行优化的具体方式为：对现有6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3基因序列进行部分氨基酸位点的密码子优化，在其C端融合“SSVDKLAAALE”linker序列及8x组氨酸标签和Flag标签。4.根据权利要求1所述的一种6-脱氧赤酮酸内酯B合酶复合体3的制备方法，其特征在于：表达培养的具体过程为：加入终浓度为0.1-0.25mM的IPTG，移入16℃的环境中表达22h，得到表达培养液；或者，用SB自诱导培养基并进行发酵罐发酵，在16-20℃的环境中发酵18-26h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马骋，易孝菡，王珂，张兴，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：