本发明专利技术公开了一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用，具体公开了一种分子间[4+2]环化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；还提供了编码该[4+2]环化酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示，及经密码子优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示，使优化后的[4+2]环化酶的基因可以在大肠杆菌中表达；同时提供了含有所述核苷酸序列的蛋白表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还公开了该[4+2]环化酶在催化分子间[4+2]环加成反应以制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其衍生物或其类似物或其立体异构体中的应用。用。
【技术实现步骤摘要】
一种[4+2]环化酶的氨基酸序列及其应用
[0001]本专利技术属于合成生物学、基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种催化分子间[4+2]环化反应的[4+2]环化酶，其氨基酸序列及其在制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其立体异构体、类似物或其衍生物中应用。
技术介绍
[0002][4+2]环加成反应，即共轭双烯(4个π电子)与亲双烯(2个π电子)反应形成环己烯骨架的反应，是有机合成中构建六元环最重要的方法之一，在六元碳环和杂环化合物的合成中占有重要地位，尤其在具有复杂结构的活性天然产物全合成中起到非常关键的作用。根据共轭双烯与亲双烯体进行反应的面的选择性不同，而底物为不对称取代时，该反应理论上可形成4个手性不同的立体异构体：包括2个endo型产物和2个exo型产物(即立体选择性)；而当反应底物具有多个可反应的位点时，该反应可生成不同结构的[4+2]环化反应产物(即区域选择性)。如何提高[4+2]环化反应的立体选择性和区域选择性一直是有机化学家们关注的焦点。
[0003]自1979年报道首例Lewis酸催化剂用于催化[4+2]环加成反应以来，越来越多的手性Lewis酸配体催化剂不断被发现。如Al、Zn等主族金属元素，Pd、Ti、Cu、Co、Rh、Ru等过渡金属元素，及镧系金属元素均可作为手性配体参与催化反应，与早期发现的热诱导的[4+2]环加成反应相比，立体选择性和区域选择性得到大大提高，且不需要高温反应。然而，多数手性催化剂价格昂贵、不易制得、需要较为严苛的反应条件(如隔绝空气、非质子性溶剂、低温等)，限制了他们在工业化生产中的应用。
[0004]近年来，随着生物技术和基因工程的发展，酶这种绿色(环境友好)、高效、高立体选择性的催化剂在天然产物及药物合成过程中扮演的角色愈发重要，同时合成生物学手段也越来越多地被应用于活性天然产物或药物的全合成过程中。目前，已有数个天然来源的[4+2]环化酶被发现能够催化分子内的[4+2]环加成反应，能够显著提高反应效率且具有很高的立体选择性，如来源于真菌Aspergillus flavus的LepI(M.Ohashi,et al.Nature,2017,549,502-506)和来源于放线菌Saccaropolyspora spinosa的SpnF(H.J.Kim,et al.Nature,2011,473,109-112)等。虽然分子内的[4+2]环化酶已有报道，但分子间的[4+2]环化酶从未被报道。然而，许多活性天然产物的生物合成途径被推测经由分子间[4+2]环加成反应而来，例如neosetophomone B。
[0005]以neosetophomone B为代表的杂萜类化合物是一类真菌次级代谢产物。该类化合物大多产自微紫青霉菌Penicillium janthinellum，Phoma sp.(J.Zhang,et al,Journal of Natural Products,2015,78,3058-3066)，Neosetophoma sp.(T.El-Elimat,et al,Organic Letters,2019,21,529-534)，Eupenicillium brefeldianum ATCC 74184(F.Mayerl,et al,Journal of Antibiotics,1993,46,1082-1088)，或Kionochaeta ramifera BCC 7585(T.Bunyapaiboonsri,et al,Phytochemistry Letters,2008,1,204-206)等，对肿瘤细胞具有强烈的细胞毒作用。其中，neosetophomone B对人卵巢癌OVCAR-8
细胞、人肺癌MSTO-211H细胞和大鼠腹水癌LLC细胞的半数抑制率分别为1.08μM、0.28μM和0.12μM。然而该类化合物在真菌代谢产物中的含量很低，限制了该类抗肿瘤化合物的进一步研究和开发。因此，找到该类杂萜化合物在真菌中的生物合成基因簇并对其中的关键蛋白进行功能鉴定，对于酶催化合成以neosetophomone B为代表的杂萜化合物或者通过合成生物学技术规模化制备该类化合物，减少由于化学合成以及提取分离等传统方法对环境造成的压力，从而促进社会可持续发展具有重要的意义。
[0006]本专利技术提供一种编码[4+2]环化酶的基因，命名为eupfF，并对其功能进行了鉴定。结果表明该[4+2]环化酶EupfF能够出乎意料的催化分子间的[4+2]环化反应。该步反应是制备抗肿瘤化合物neosetophomone B的关键反应。
技术实现思路
[0007]本专利技术解决的技术问题是提供一种分子间[4+2]环化酶、编码该酶的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该核苷酸序列或表达载体的宿主细胞，以及其在催化分子间[4+2]环化反应中的应用。该反应可用于制备抗肿瘤化合物neosetophomone B及其立体异构体、衍生物、或其类似物。
[0008]为解决本专利技术的技术问题，采用如下技术方案：
[0009]本专利技术技术方案的第一方面提供了一种分子间[4+2]环化酶EupfF，其特征在于，其氨基酸序列为：
[0010](1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0011](2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。
[0012]以上所述的[4+2]环化酶EupfF，其特征在于，在[4+2]环化酶EupfF上可进行常规修饰；或者在[4+2]环化酶EupfF上还连接有用于检测或纯化的标签。
[0013]其中，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。
[0014]本专利技术技术方案的第二方面提供了一种编码第一方面所述[4+2]环化酶EupfF的核酸分子，其特征在于：
[0015](1)序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；
[0016](2)基于SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列根据大肠杆菌的密码子偏好性进行序列优化得到的序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；
[0017](3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0018]其中，以上(2)中所述的经密码子优化后的核苷酸序列更容易在大肠杆菌中表达形成可溶性的[4+2]环化酶EupfF。
[0019]术语“编码[4+2]环化酶EupfF的核酸分子”是指包括编码[4+2]环化酶EupfF多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列，它包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种[4+2]环化酶，其特征在于，其氨基酸序列为：(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的[4+2]环化酶，其特征在于，在该[4+2]环化酶上可进行常规修饰；或者还连接有用于检测或纯化的标签。3.根据权利要求2所述的[4+2]环化酶的修饰，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。4.一种编码权利要求1所述[4+2]环化酶的核酸分子。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：(1)序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；(2)基于SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列根据大肠杆菌的密码子偏好性进行序列优化得到的序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。6.一种含有权利要求4-5任一所述核酸分子的表达载体。7.一种含有权利要求4-5任一所述核酸分子或权利要求6所述表达载体的宿主细胞。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，其宿主细胞选自细菌，酵母，曲霉菌，植物细胞，或昆虫细胞。9.权利要求1-3任一项所述的[4+2]环化酶或权利要求4-5任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体或权利要求7-8任一项所述的宿主细胞在催化分子间[4+2]环化反应中的应用。10.根据权利要求9...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡友财，陈其宾，高洁，刘家旺，柏健，刘冰语，张晨，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：
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