用于在癌症疗法中靶向坏死的人源化抗核抗体制造技术

提出了具有增强的结合亲和力和肿瘤摄取的人源化单克隆抗核抗体。特别优选的抗体是H‑CDR3的定点突变体，与非人源化非突变的形式相比，该定点突变体具有高达约8倍提高的亲和力。在另外优选的方面，将此类人源化抗体用于肿瘤坏死靶向地递送免疫调节剂、免疫效应物、和其他治疗剂或诊断剂。

Humanized antinuclear antibody for targeting necrosis in cancer therapy

A humanized monoclonal antinuclear antibody with enhanced binding affinity and tumor uptake was proposed. The preferred antibody is a site-specific mutant of H \u2011 CDR3, which has a high affinity of about 8 times compared with the non humanized non mutated form. In a further preferred aspect, such humanized antibodies are used for tumor necrosis targeted delivery of immunomodulators, immune effectors, and other therapeutic or diagnostic agents.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在癌症疗法中靶向坏死的人源化抗核抗体相关申请的交叉引用本申请要求于2017年3月20日提交的美国临时专利申请序列号US62/473,554的优先权权益，其内容通过引用并入本文。
本专利技术的领域涉及抗体，并且特别是涉及靶向肿瘤坏死的人源化抗体。
技术介绍
本背景描述包括可用于理解本专利技术的信息。这并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，或者明确或隐含地引用的任何出版物是现有技术。所有出版物和专利申请通过引用结合在此，其程度就像这些出版物或专利申请中的每一个都是明确地和单独地通过引用结合在此的一样。当并入的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。先前针对在细胞死亡后可获得的通用的细胞内抗原的单克隆抗体已经用于实体瘤的免疫疗法中(参见，例如，CancerResearch[癌症研究],48:5842-5848,1988；Hybridoma[杂交瘤],12(6):689-698,1993；或CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals[癌症生物疗法和放射性药物],13(4):255-68,1998)。有利地，这种方法靶向存在于所有肿瘤中但通常在身体的正常组织中不可获得的肿瘤坏死区域。例如，已经研究了三种“肿瘤坏死靶向(“TNT”)鼠单克隆抗体，并且其包括针对组蛋白H1和DNA的muTNT-1，与组蛋白组分H1和H3的共同表位结合的muTNT-2，和主要结合单链DNA的muTNT-3。值得注意的是，荷瘤小鼠的生物分布分析表明，与muTNT-1和muTNT-2相比，TNT-3在肿瘤中显示出最高摄取，并且已经提出了TNT-3用于实体瘤的放射免疫疗法(参见，例如，CancerBiotherRadiopharm[癌症生物治疗和放射药物]1998年8月；13(4):255-68)。在可替代的方法中，构建了嵌合TNT-3抗体/鼠干扰素-γ融合蛋白用于实体恶性肿瘤的免疫疗法(参见，例如，HybridHybridomics[杂合杂交瘤]2003年8月；22(4):197-207)并且其展现出各种所希望的特征。遗憾地，鼠单克隆抗体在人中具有免疫原性，并因此在人患者中具有极大受限的治疗潜力。为帮助解决与免疫原性相关联的问题，使用人恒定区和鼠可变区构建嵌合TNT-3抗体，所述人恒定区占该嵌合TNT-3抗体分子的65％。然而，由于这种嵌合抗体仍包含约35％的鼠残基，抗体保持免疫原性。为进一步降低嵌合抗体的免疫原性，可以采用各种方法。最简单的人源化方法之一是互补决定区(CDR)移植，其中六个抗体CDR被简单地移植到相应的人框架区中，这进一步使鼠残基的数量减少了约25％。遗憾地，尽管CDR移植至少在某些情况下已被成功用于若干种抗体的人源化，但移植通常改变结合谱，导致对抗原的亲和力的不希望的降低(参见，例如，JMolBiol[分子生物学杂志]224:487-499,1992)，如其他地方所报道的，所述降低高达数百倍(参见，例如，Proc.NatlAcad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89(10):4285-9,1992)。因此，在大多数情况下，必须将CDR移植与一些框架残基的微调相结合，这些框架残基对于恢复人源化抗体的亲和力可能是重要的。然而，可能有助于CDR结构的重要框架残基的数量相对较多，并且经常妨碍基于原理的抗体设计。而且，框架残基与一个或多个CDR之间的相互作用进一步使分析复杂化，使得微调方法通常耗时且不可预测。在又另一种方法中，通过CDR的逐步突变恢复人源化抗体的亲和力(参见，例如，Proc.NatlAcad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],95,6037-6042,1998)。仍有一些报道，VH链的CDR区的多样性对于大多数抗体特异性是足够的，并且指出体细胞突变可以实现出人意料的高亲和力。实际上，H-CDR3显示出在抗原结合中起主导作用，如通过早期研究所示，所述早期研究表明单独的重链或甚至单个VH结构域能以与完整抗体相当的亲和力结合抗原(参见，例如，Nature[自然]341,544-546,1989；和J.Immunol.Methods[免疫方法杂志]193,177-187,1996)。当然，所选CDR的修饰可能再次导致结合位点的整体构型的变化，又再次导致高水平的不可预测性。因此，存在对于允许靶向肿瘤微环境(特别是坏死细胞)的人源化抗体组合物和方法的需要，以允许对肿瘤的免疫应答进行位点特异性调节。
技术实现思路
本专利技术的主题涉及具有提高的结合特征的人源化TNT抗体的组合物以及产生和使用所述抗体的方法。在本专利技术的主题的一个方面，诸位专利技术人考虑了相对于相应的非人源化抗体，对核靶标(例如，DNA，尤其是单链DNA(ssDNA))具有提高的结合亲和力的人源化抗核抗体。特别地，预期的人源化抗体比相应的非人源化抗体具有高至少2倍，更典型地至少4倍，并且最典型地至少8倍的结合亲和力。而且，相对于相应的非人源化抗体，优选的人源化抗体在H-CDR3中具有突变的氨基酸。例如，H-CDR3中突变的氨基酸可以是107Phe→Arg、101Ile→His、102Gly→Arg、109Tyr→Thr、103Val→Ser、104Arg→Thr、109Tyr→Arg、和104Arg→Leu。从不同的角度看，人源化抗体可以具有以下各项中的至少一种：包含TRYWMH(SEQIDNO:1)的H-CDR1序列、包含GAIYPGNSDTSYNQKFKG(SEQIDNO:2)的H-CDR2序列、包含EEIGVRRWFAY(SEQIDNO:3)的H-CDR3序列、包含RARQSISNYLH(SEQIDNO:4)的L-CDR1序列、包含ASQSIS(SEQIDNO:5)的L-CDR2序列、和包含QQSNSWPLT(SEQIDNO:6)的L-CDR3序列。因此，在仍另外预期的方面，人源化抗体可以具有VH序列，该VH序列包含：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYWMHWVRQAPGQALEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKGKATITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEEIGVRRWFAYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:7)；和/或具有VL序列，该VL序列包含：IVLTQSPATLSLSPGERATLSCRARQSISNYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:8)。在本专利技术的主题的另一个方面，诸位专利技术人还考虑了杂合分子，该杂合分子至少包括本文预期的与治疗剂和/或显像剂偶联的人源化抗体的结合部分。例如，抗体的合适的结合部分包括全长抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab2片段、和scFvs，而预期的治疗剂包括细胞因子或其部分、趋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化抗核抗体，相对于相应的非人源化抗体，该人源化抗核抗体对核靶标具有提高的结合亲和力。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170320 US 62/473,5541.一种人源化抗核抗体，相对于相应的非人源化抗体，该人源化抗核抗体对核靶标具有提高的结合亲和力。


2.如权利要求1所述的人源化抗体，其中该核靶标是单链DNA。


3.如权利要求1-2中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有比相应的非人源化抗体高至少2倍的结合亲和力。


4.如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有比相应的非人源化抗体高至少4倍的结合亲和力。


5.如权利要求1-4中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有比相应的非人源化抗体高至少8倍的结合亲和力。


6.如权利要求1-5中任一项所述的人源化抗体，其中相对于相应的非人源化抗体，该人源化抗体在H-CDR3中具有突变的氨基酸。


7.如权利要求6所述的人源化抗体，其中H-CDR3中突变的氨基酸选自下组，该组由以下组成：107Phe→Arg、101Ile→His、102Gly→Arg、109Tyr→Thr、103Val→Ser、104Arg→Thr、109Tyr→Arg、和104Arg→Leu。


8.如权利要求1-7中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有以下各项中的至少一种：
H-CDR1序列，其包含TRYWMH(SEQIDNO:1)；
H-CDR2序列，其包含GAIYPGNSDTSYNQKFKG(SEQIDNO:2)；
H-CDR3序列，其包含EEIGVRRWFAY(SEQIDNO:3)；
L-CDR1序列，其包含RARQSISNYLH(SEQIDNO:4)；
L-CDR2序列，其包含ASQSIS(SEQIDNO:5)；以及
L-CDR3序列，其包含QQSNSWPLT(SEQIDNO:6)。


9.如权利要求1-6中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有VH序列，该VH序列包含





10.如权利要求1-6中任一项所述的人源化抗体，其中该人源化抗体具有VL序列，该VL序列包含IVLTQSPATLSLSPGERATLSCRARQSISNYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSNSWPLTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:8)。


11.一种杂合分子，该杂合分子包含与治疗剂和显像剂中至少一种偶联的如权利要求1-10中任一项所述的抗体的至少结合部分。


12.如权利要求11所述的杂合分子，其中该抗体的至少结合部分是全长抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab2片段、或scFv。


13.如权利要求11-12中任一项所述的杂合分子，其中该治疗剂包含以下各项中的至少一种：细胞因子或其部分、趋化因子或其部分、髓源性抑制细胞(MDSC)的抑制剂、M2巨噬细胞的抑制剂、放射性同位素、共刺激分子、toll样受体(TLR)激动剂或配体、干扰上皮间充质转化(EMT)的分子、和化学治疗药。


14.如权利要求11-12中任一项所述的杂合分子，其中该显像剂包含放射性同位素、PET标记、和SPECT标记中的至少一种。


15.一种药物组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的抗体或如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·爱泼斯坦，胡培声，
申请(专利权)人：癌症治疗实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US