抑制CD39表达的免疫抑制恢复寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰，并且该寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的外核苷酶(NTPdase；CD73)的核酸序列杂交，其中该寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达。本发明专利技术还涉及包含这种寡核苷酸的药物组合物。

Immunosuppressive recovery of oligonucleotides by inhibiting the expression of CD39

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制CD39表达的免疫抑制恢复寡核苷酸
本公开涉及与外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ENTPD1或CD39)的核酸序列杂交的免疫抑制恢复寡核苷酸，以及包含这种免疫抑制恢复寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
技术介绍
近年来，通过应用免疫疗法，特别是通过所谓的“免疫检查点”的抑制剂，对如恶性肿瘤的几种不同疾病的治疗非常成功。这些检查点是免疫系统中的分子，其上调(共刺激分子)或下调信号。治疗方法的概念基于内源性抗肿瘤免疫反应的激活。例如，许多癌症分别通过抑制T细胞和NK细胞活性来保护自己免受免疫系统的侵害。免疫检查点调节剂，即刺激剂或抑制剂，例如针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、BTLA、IDO、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、MICA、NKG2A、KIR、TIGIT、TGF-β、Ox40、GITR、CD27、CD160、2B4和4-1Bb中的一种或多种。CD39需要被认为是改进对不同类型癌症的免疫力的一种新颖且有前景的候选物。CD39是一种外核苷酶(NTPdase)，负责将ATP转化为ADP，和将ADP转化为AMP。其与外核苷酶CD73协同作用，CD73将AMP降解为免疫抑制性腺苷。CD39在不同的免疫细胞上广泛表达为单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、树状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)的一些亚群和T细胞。主要是Treg细胞突出表达CD39和CD73，使它们能够产生腺苷以抑制T细胞反应。此外，已经在许多不同的肿瘤(实体和血液肿瘤)和肿瘤相关免疫细胞中发现了增强的CD39表达水平。例如，在黑色素瘤中，已经在黑色素细胞上研究了增加的CD39表达，并且发现其与它们分化成恶性细胞有关。此外，在来自肾、肺、睾丸、甲状腺肿瘤以及淋巴瘤的癌细胞上研究了增强的CD39mRNA和蛋白质水平。不同肿瘤中的这些增加的CD39的表达水平强烈表明该外核苷酶在肿瘤诱发、生长和免疫抑制微环境介导中的重要作用。垂死的癌细胞将ATP释放到肿瘤微环境中的细胞外空间。由于免疫抑制性腺苷的产生，活肿瘤细胞可从ATP中获益。由此，肿瘤细胞能够进行不受控制的增殖和扩增。如上所述，不同的肿瘤细胞或肿瘤相关的免疫细胞显示出有效的CD39和CD73表达，导致肿瘤微环境中腺苷水平的增加。通过与淋巴细胞上的A2A或A2B受体结合，腺苷介导对这些细胞的免疫抑制信号。例如，T细胞的增殖、细胞毒性细胞因子产生和激活受到抑制。NK细胞显示出降低的细胞毒性潜力。腺苷诱导巨噬细胞中的替代激活(免疫抑制性M2表型)，导致促炎性细胞因子产生减少，但免疫抑制性细胞因子IL-10的产生增加。CD39作为相关治疗靶标在不同肿瘤中的重要作用由以下事实强调：使用CD39和CD73敲除小鼠的肿瘤模型显示出改善的疾病结果。然而，CD39的抑制很可能比单独CD73的抑制更有效，以增强抗肿瘤免疫应答。一方面，因为CD39的阻断会导致肿瘤微环境中腺苷水平降低。另一方面，肿瘤微环境中的高ATP水平可以充当DC、巨噬细胞及其介导免疫刺激信号的前体的“发现我”信号。ATP与DC上的P2X7受体结合并激活它们以释放促炎细胞因子如IL-1β或IL-28。这些细胞因子转而激活NK细胞、T细胞和巨噬细胞并增强它们的增殖、细胞毒性和成熟。因此，T细胞受体(TCR)的参与导致T细胞激活期间的ATP释放。该ATP可以通过P2X受体以自分泌的方式起作用，以增强TCR触发的激活和IL-2的产生。相同的ATP可能通过P2X受体以旁分泌的方式作用于邻近的淋巴细胞，以抑制它们在淋巴结中的运动，从而增强T细胞和APC之间的相互作用。总之，增加肿瘤微环境中的ATP水平为启动最佳抗肿瘤免疫应答设定了完美条件。为了阻断CD39外核苷酶活性，抗人CD39单克隆抗体如IPH52(Bastidet,al,CancerImmunologyResearch,2014)和OREG-103/BY40(Bennefoyet,al,OncoImmunology4:5,2015)目前正在进行临床前研究，其导致动物模型的预期寿命延长。然而，由于空间位阻，这些单克隆抗体可能无法定位于肿瘤微环境。此外，CD39的小分子抑制剂如ARL67156(OncoImmunology1:3；2012)和POM-1(Gastroenterology；2010；139(3):1030-1040)已经在动物模型中体外和体内测试，导致肿瘤生长减少。然而，这些小分子由于其低活性和体内半衰期短而必须以高剂量和高频率给予。免疫疗法已经导致长期缓解，但到目前为止只对小患者群体。原因可能是许多免疫检查点和可选的其它免疫抑制机制参与例如免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用。免疫检查点和潜在的其它机制的组合可以根据肿瘤和受试者的个体状况而不同，以逃避身体的防御。为了抑制几种免疫抑制机制，使用抗体和/或小分子的常用方法不适合或几乎不适合，因为分子靶标位于细胞内或不具有酶活性。因此，安全有效地抑制如CD39的“免疫检查点”功能的药剂将是治疗患有例如由该酶活性影响的疾病或病症的患者的重要补充。本专利技术的寡核苷酸分别在抑制CD39的表达和活性方面非常成功。寡核苷酸的作用方式不同于抗体或小分子的作用方式，并且寡核苷酸对于例如以下是非常有利的(i)肿瘤组织在实体肿瘤中的渗透，(ii)分别阻断靶标的多项功能和活动，(iii)寡核苷酸彼此或与抗体或小分子的组合，和(iv)抑制对于抗体是不可接近的或通过小分子可抑制的细胞内效果。因此，通过反义寡核苷酸在mRNA水平上靶向癌症和免疫细胞上的CD39表达是开发和改进例如分别针对不同癌症和免疫疾病的免疫疗法的有前景的最新技术方法。
技术实现思路
本专利技术涉及寡核苷酸，如包含约10至20个核苷酸的免疫抑制恢复(immunosuppression-reverting)寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰。寡核苷酸与例如SEQIDNO.1(人)的外核苷酶CD39的核酸序列和/或SEQIDNO.2(小鼠/大鼠)的序列杂交。修饰的核苷酸例如选自由桥接核酸(例如，LNA、cET、ENA、2’氟修饰的核苷酸或2'O-甲基修饰的核苷酸，及它们的组合)组成的组。在一些实施方式中，寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达，并且在一些实施方式中，寡核苷酸以纳摩尔浓度抑制CD39的表达。与RNAi相比，反义寡核苷酸具有显着的优势。可以在体外转染反义寡核苷酸而不转染试剂，因此与使用专门转染RNAi的转染试剂的转染相比，该转染更接近体内条件。在不同组织中体内全身给予反义寡核苷酸是可能的，而体内给予RNAi依赖于递送系统，如GalNAc，例如在肝脏中。此外，反义寡核苷酸比RNAi短，因此在合成和吸收入细胞方面较不复杂。RNAi规律地显示同样可以启动RNAi的随从链的脱靶(off-target)效果。随从链RISC加载是RNAi药物的重要问题，因为随从链可能将RNAi活性导向非预期的靶标，导致毒副作用。“(参见Chackalamannil,Rotella,Ward,ComprehensiveModicinalChemistryIIIElsevier,03.06.2017)。反义寡核苷酸不包含随从链。本专利技术还涉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中，至少一个所述核苷酸被修饰，并且所述寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的外核苷酶(NTPdase)CD39的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.07 EP 16192807.2;2017.08.24 EP 17187774.91.一种包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中，至少一个所述核苷酸被修饰，并且所述寡核苷酸与SEQIDNO.1(人)的外核苷酶(NTPdase)CD39的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，修饰的所述核苷酸选自由桥接核酸如LNA，cET，ENA，2’氟修饰的核苷酸，2'O-甲基修饰的核苷酸和它们的组合组成的组。3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其与SEQIDNO.1的人(h)CD39杂交，包含选自由以下组成的组的序列：SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38、SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.45、SEQIDNO.46、SEQIDNO.47、SEQIDNO.48、SEQIDNO.49、SEQIDNO.50、SEQIDNO.51、SEQIDNO.52、SEQIDNO.88、SEQIDNO.89、SEQIDNO.90、SEQIDNO.91、SEQIDNO.92、SEQIDNO.93、SEQIDNO.94、SEQIDNO.95、SEQIDNO.96、SEQIDNo.97和它们的组合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T(A04040H)、+C*+A*+C*T*T*A*C*G*T*T*C*A*C*T*+A*+C*+C(A04045H)、+G*+G*+C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04001H)、+C*+T*+C*C*A*G*C*G*T*A*A*G*+A*+T(A04002H)、+T*+T*+G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T(A04003H)、+G*+C*C*A*T*A*G*G*C*A*C*C*+T*+T*+C(A04004H)、+C*+T*+A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*+A*+C*+C(A04005H)、+T*G*+T*A*G*A*G*G*C*T*C*C*C*+C*+C(A04006H)、+T*+T*+G*C*A*G*A*G*C*A*T*T*+A*+T*+C(A04007H)、+A*+G*+G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04008H)、+T*+A*G*A*C*A*T*T*G*T*A*G*+T*+C*+C(A04009H)、+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04010H)、+A*+A*+T*C*C*C*C*C*T*G*G*A*+G*+T*+G(A04011H)、+A*+G*+C*G*T*A*A*G*A*T*G*T*+T*+T*+T(A04012H)、+A*+C*+T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04013H)、+T*+G*+A*T*A*G*C*C*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04014H)、+A*+G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*T*+C(A04015H)、+G*G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*+C*+T*+C(A04016H)、+C*+T*+T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T(A04017H)、+G*+A*G*T*A*C*A*A*C*T*G*A*+A*+C*+C(A04018H)、+G*+T*+A*A*G*C*C*C*T*G*A*T*+G*+T*+T(A04019H)、+T*+A*+T*G*G*T*A*C*A*G*T*+T*G*+G*+T(A04020H)、+C*+T*+G*A*C*T*G*A*A*T*T*T*G*+C*+C*+C(A04021HM)、+A*+C*+T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*A*+C*+C(A04022HM)、+G*+A*C*T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*+C*+A*+C(A04023HM)、+G*+A*+G*G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*A*+G*+A(A04024HM)、+A*+G*A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04025H)、+G*+A*+T*A*G*T*T*T*C*C*A*A*T*+A*+C*+C(A04026H)、+T*+A*+C*T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04027H)、+A*+T*+G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*G*T*+C*+C(A04028H)、+C*+A*+T*G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*+G*+T*+C(A04029H)、+G*+G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*C*+T*C*+A(A04030H)、+A*+G*+C*C*T*A*T*G*A*T*G*G*C*C*+A*+C(A04...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克·亚申斯基，塔玛拉·希尔梅纽克，
申请(专利权)人：瑟卡尔纳制药有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE