一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于荧光标记多糖技术领域，尤其涉及一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用，包括：1)透明质酸‑酪胺的合成：取8000、20‑40万、70‑90万三种分子量的透明质酸，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸‑酪胺溶液；2)透明质酸‑酪胺‑FITC的合成：在步骤1)制备的三种透明质酸‑酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素，反应完成后，得到三种透明质酸‑酪胺‑FITC溶液。本发明专利技术采用FITC标记的不同分子量的透明质酸完全可以成为多糖标记中的Marker，能够快速检测多糖标记成功与否。

A Standard for Electrophoresis of Acidic Polysaccharides and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用
本专利技术属于荧光标记多糖
，尤其涉及一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用。
技术介绍
本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。二十一世纪是糖化学和糖生物学发展的重要时期，随着科学的不断发展，多糖在食品和药品中发挥着越来越重要的作用。多糖是一类复杂的化合物，不同分子量的多糖具有不同的生物活性，甚至有些多糖分子量不同，生物活性截然相反。因此多糖分子量的测定是多糖的一个重要指标。目前多糖分子量测定的方法主要包括高效液相凝胶色谱法、多角度激光散射法和琼脂糖电泳法。然而，本专利技术人认为：多角度激光散射法是目前测定多糖绝对分子量较为精确的仪器，但是价格较高，不适合普通实验室推广使用，而且采用此仪器测定新样品的分子量需要较多的样品，也是其难以推广的原因之一。目前较为常用的方法是高效液相凝胶色谱法，该法同样需要高效液相色谱仪、高效凝胶色谱柱、示差检测器、标准分子量多糖标准品等，需要较高的条件才能测定多糖的分子量。琼脂糖电泳是一种简便的测定多糖纯度和分子量的一种方法，但是需要沉淀、染色、漂洗等步骤，灵敏度较低。
技术实现思路
针对上述存在的问题，为了提高琼脂糖电泳的灵敏度，本专利技术提供一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用，本专利技术采用FITC标记的不同分子量的透明质酸完全可以成为多糖标记中的Marker，能够快速检测多糖标记成功与否。本专利技术第一目的：提供一种酸性多糖电泳标准品的制备方法。本专利技术第二目的：提供一种透明质酸-酪胺-FITC标准品。本专利技术第三目的：提供所述透明质酸-酪胺-FITC标准品的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术公开了下述技术方案：首先，本专利技术公开一种酸性多糖电泳标准品的制备方法，包括如下步骤：(1)透明质酸(HA)-酪胺的合成：取8kDa、200-400kDa、700-900kDa三种分子量的透明质酸(HA)，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸-酪胺溶液，备用。(2)透明质酸(HA)-酪胺-FITC的合成：在步骤(1)制备的三种透明质酸-酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素(FITC)，反应完成后，得到三种透明质酸-酪胺-FITC溶液，即可。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述碱性磷酸盐缓冲液的pH为7.3-7.8。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述酪胺Tyr的添加量为：透明质酸质量的3-4.5倍。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述溶解的条件为：在3-5℃下溶解10-14h。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述加入酪胺Tyr后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应22-25h。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述氰基硼氢化钠的加入量为酪胺Tyr质量的0.5-0.8倍。作为进一步的技术方案，步骤(1)中，所述加入氰基硼氢化钠后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应94-98h。作为进一步的技术方案，步骤(2)中，所述反应条件为：在150-200r/min的摇床中，36-42℃条件下反应33-37h。作为进一步的技术方案，步骤(2)中，所述异硫氰酸荧光素的加入比例为分子量8kDa的透明质酸质量的0.2-0.5倍。作为进一步的技术方案，所述酸性多糖电泳标准品的制备方法还包括透明质酸-酪胺-FITC的纯化，包括如下步骤：分别对步骤(2)得到的三种透明质酸-酪胺-FITC溶液进行离心，取各自的上清液，对三种上清液分别进行超滤，脱除浓缩液中分子量小于1kDa的小分子物质，收集三种透明质酸-酪胺-FITC的浓缩液；采用Superdex30进一步脱除小分子物质(分子量小于1kDa)，收集第一峰，冻干，得纯品透明质酸-酪胺-FITC标准品，即酸性多糖电泳标准品。作为进一步的技术方案，所述三种透明质酸-酪胺-FITC溶液离心上清液分别通过MiniKrosSamplermPES中空纤维膜过滤组件1-5kDa进行超滤，脱除溶液液中的分子量小于1kDa的小分子物质，收集三种透明质酸-酪胺-FITC的浓缩液。作为进一步的技术方案，所述超滤的方法为：每次取10mL浓缩液稀释10倍体积，连续超滤3-5次。作为进一步的技术方案，所述进一步脱除小分子物质采用Superdex30。其次，本专利技术公开所述酸性多糖电泳标准品的制备方法制备的透明质酸-酪胺-FITC标准品。再次，本专利技术公开所述透明质酸-酪胺-FITC标准品在多糖分子量测定中的应用，优选为在琼脂糖电泳法中的应用。作为进一步的技术方案，所述应用中，三种分子量的透明质酸的质量比为1-1.5:0.9-1.1:0.8-1.2。作为进一步的技术方案，所述透明质酸-酪胺-FITC标准品在多糖常规电泳方法之琼脂糖电泳法中的应用为：S1、试剂配制：1)电泳缓冲液：将巴比妥钠溶于纯水中，然后用盐酸调节pH值至8.5-9.0，即得；2)琼脂糖溶液：将琼脂糖溶于步骤1)的电泳缓冲液，加热溶解；3)LoadingBuffer：医用甘油；4)溴酚蓝：采用步骤1)的电泳缓冲液配制；5)FITC溶液：采用步骤1)的电泳缓冲液配制；6)透明质酸-酪胺-FITCMarker溶液：将所述三种透明质酸-酪胺-FITC混合后溶于电泳缓冲液中，电泳待测。7)按标记透明质酸方法标记聚甘露糖醛酸(PM)，将得到的荧光标记聚甘露糖醛酸(FITC-PM)溶于电泳缓冲液中，电泳待测；S2、琼脂糖电泳：将琼脂溶液静置，待琼脂糖凝胶凝固后转入电泳槽，接着加入电泳缓冲液并使液面没过胶面，然后依次上样：溴酚蓝、FITC溶液、透明质酸-酪胺-FITCMarker溶液、荧光标记聚甘露糖醛酸溶液，电泳至溴酚蓝到达胶的底端，停止电泳，凝胶成像仪下观察凝胶，记录图像结果，即可。与现有技术相比，本专利技术取得了以下有益效果：(1)以往只有单糖寡糖可以被标记，本专利技术成功地标记了不同分子量范围的透明质酸，解决了多糖透明质酸难以标记或者标记不成功的难题。(2)本专利技术使不同分子量范围的透明质酸衍生为可被灵敏检测到的荧光探针，使透明质酸的检测更加灵敏准确方便。(3)本专利技术标记后的透明质酸可以作为检测其它多糖的marker，从而能检测其他多糖的标记效果和估算其分子量。(4)本专利技术可以通过多糖琼脂糖常规电泳方法快速方便检测被检测多糖标记效果。(5)本专利技术通过多糖琼脂糖常规电泳方法估算被检测多糖的分子量。(6)本专利技术以标记后的聚甘露糖醛酸为检测对象验证了此方法的灵敏度和准确性。(7)本专利技术简化了多糖琼脂糖常规电泳方法的操作，省去了操作中常规多糖沉淀、染色、漂洗等步骤，提高了多糖检测的灵敏度和准确度，节省实验时间，提高了实验效率。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例2中ANTS标记透明质酸电泳结果图。图2为本专利技术实施例3中FITC两种方案标记1400kDa透明质酸电泳结果。图3为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酸性多糖电泳标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)透明质酸‑酪胺的合成：8kDa、200‑400kDa、700‑900kDa三种分子量的透明质酸，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸‑酪胺溶液，备用；(2)透明质酸‑酪胺‑FITC的合成：在步骤(1)制备的三种透明质酸‑酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素，反应完成后，得到三种透明质酸‑酪胺‑FITC溶液。

【技术特征摘要】
1.一种酸性多糖电泳标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)透明质酸-酪胺的合成：8kDa、200-400kDa、700-900kDa三种分子量的透明质酸，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸-酪胺溶液，备用；(2)透明质酸-酪胺-FITC的合成：在步骤(1)制备的三种透明质酸-酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素，反应完成后，得到三种透明质酸-酪胺-FITC溶液。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，步骤(1)中，所述碱性磷酸盐缓冲液的pH为7.0-7.8；优选地，步骤(1)中，所述酪胺Tyr的添加量为：透明质酸质量的3-4.5倍。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶解的条件为：在3-5℃下溶解10-14h；优选地，步骤(1)中，所述加入酪胺Tyr后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应22-25h。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氰基硼氢化钠的加入量为酪胺Tyr质量的0.5-0.8倍；优选地，步骤(1)中，所述加入氰基硼氢化钠后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应94-98h。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应条件为：在150-200r/min的摇床中，36-42℃条件下反应33-37h；优选地，步骤(2)中，所述异硫氰酸荧光素的加入比例为：所述异硫氰酸荧光素的加入比例为分子量8kDa的透明质酸质量的0.2-0.5倍。6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酸性多糖电泳标准品的制备方法还包括透明质酸-酪胺-FITC的纯化，包括如下步骤：分别对步骤(2)得到的三种透明质酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淑亮，张娥，王宇，吉爱国，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37