一种制备金针菇子实体组织切片的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备金针菇子实体组织切片的方法，涉及生物组织学技术领域。制备金针菇子实体组织切片的方法包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡与切片、展片与烤片、脱蜡、复水、染色和封片十一大步骤。本发明专利技术制备金针菇子实体组织切片的方法具有快捷、安全、环保和实用的优势，该方法得到的结果可操作性强、可重复率高、稳定可靠，在显微镜下观察切片着色性好、效果好、组织结构清晰完整。该方法可用于研究、观察及金针菇子实体组织的形态结构变化，进而对金针菇的生理、病理和形态学进行细胞学层面的深入研究，还可广泛应用于其它食用菌组织切片实验中，具有较好的科研应用前景。

A Method for Preparing Fruiting Body Tissue Slices of Flammulina velutipes

【技术实现步骤摘要】
一种制备金针菇子实体组织切片的方法
本专利技术涉及生物组织学
，具体而言，涉及一种制备金针菇子实体组织切片的方法。
技术介绍
目前针对金针菇子实体的发育研究主要集中在环境调控、基因分析和遗传育种等方面，而针对其子实体的细胞学结构研究还比较少见，这一缺失极大限制了金针菇生理、病理和形态学的研究的深入开展。金针菇子实体的组织观察对于金针菇生理、病理和形态学的研究极为关键。现有技术中，石蜡切片常采用二甲苯作为透明剂。而二甲苯具有细胞学毒性，具体体现在诱导线粒体解偶联和氧化应激反应且能通过呼吸道和皮肤粘膜进入人体，损害神经和血液系统，引起神经衰弱、植物神经紊乱和皮肤粘膜刺激等症状。因此，提供一种制备金针菇子实体组织切片的方法尤为重要。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备金针菇子实体组织切片的方法，该方法采用柠檬烯作为金针菇石蜡切片操作中重要的透明剂和脱蜡剂，在获得清晰图像质量的金针菇子实体组织切片的同时，极大减少了操作环境的污染，保证了操作人员的人身安全。本专利技术是这样实现的：一种制备金针菇子实体组织切片的方法，包括如下依次进行的步骤，先将经脱水处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的混合液中进行初步透明处理，再将初步透明处理的金针菇材料浸泡于柠檬烯中进行二次透明处理；将经二次透明处理后的金针菇材料放入柠檬烯与液体石蜡混合液中进行初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料放入液体石蜡中进行二次浸蜡处理；然后将经二次浸蜡处理后的金针菇材料依次进行包埋处理，切片和烤片，将烤片处理的载玻片放入柠檬烯中浸泡脱蜡。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述在脱水处理前还包括固定步骤，具体包括选取新鲜的金针菇菌褶、菌柄组织作为石蜡切片的试验材料；将所选的试验材料切成长为0.45-0.50cm的小块，放入FAA固定液中，于室温下固定16h。通过固定处理，有利于将金针菇试验材料细胞中的蛋白质，糖原和组织液等成分凝固或沉淀，使细胞或组织基本上保持原活性条件下的成分，以利于对细胞形态及组织学的研究。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述脱水处理步骤具体包括将固定处理后的实验材料用体积浓度为70％、85％、95％的乙醇中分别处理30min，最后放置在纯乙醇中处理2次，每次30min。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述初步透明处理具体包括先将金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的体积比为0.8-1.2:1.8-2.2的溶液中处理25-35min，再将处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与乙醇染色液的体积比为1.7-2.3:0.9-1.1的混合液中染色处理25-35min，二次透明处理包括将染色处理后的金针菇材料在柠檬烯中处理1-3次，每次25-35min；优选的，初步透明处理具体包括先将金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的体积比为1:2的溶液中处理30min，再将处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与乙醇染色液的体积比为2:1的混合液中染色处理30min，乙醇染色液为乙醇番红O染色液，乙醇番红O染色液的浓度为10g/L，二次透明处理包括将染色处理后的金针菇材料在柠檬烯中处理2次，每次30min。通过逐步透明处理的方法，可以防止金针菇材料直接浸泡在纯柠檬烯中发生切片的脆裂和硬化，这种逐步透明处理的方法可以显著提升成品的质量。透明处理时，将实验材料浸泡于柠檬烯和纯乙醇的混合液中，有利于试验材料在短时间内与柠檬烯和纯乙醇的混合液充分接触，提升置换金针菇组织内的脱水剂效率，为下一步浸蜡起到桥梁的作用。通过添加番红O染色液有利于对组织进行初步染色，保证后续修蜡和切片处理时不会对组织造成损伤。对染色后的试验材料进行柠檬烯透明处理，保证试验材料为荧光粉红色，呈通透红。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述柠檬烯为D-柠檬烯，L-柠檬烯或DL-柠檬烯中的任意一种，优选的，柠檬烯为D-柠檬烯。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述初步浸蜡处理具体包括将二次透明处理后的金针菇材料放入柠檬烯中，在52-57℃下，每隔1.8-2.2h向柠檬烯中添加1-2g石蜡，当总的溶液体积达到柠檬烯体积的1.9-2.1倍时，停止添加石蜡，保温12h完成初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料置于新的液体石蜡中进行二次浸蜡处理，在58℃下保温处理3-4次，每次处理24h；优选的，在55℃下，每隔2h向柠檬烯中添加1.5g石蜡，当总的溶液体积达到柠檬烯体积的2倍时，停止添加石蜡，保温12h完成初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料置于新的液体石蜡中进行二次浸蜡处理，在58℃下保温处理3次，每次处理24h。通过二次浸蜡工艺可以尽可能的减少浸蜡时对金针菇材料的损伤，提升制得成品的成功率和完整性。通过浸蜡处理可以置换组织中的透明剂，为后续包埋处理做准备，使试验材料中的柠檬烯溶于石蜡中。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述包埋处理具体包括如下步骤：将金针菇材料放入含液面高度为1-1.5cm的石蜡液的包埋容器中，待蜡面凝固，然后将包埋容器置于-4℃-5℃中保持2h以上。将纸盒置于-4℃-5℃的作用是保证试验材料在石蜡液中充分自然凝固，该操作可以在冰水中进行保温凝固处理。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述包埋处理还包括预热处理步骤，具体包括对包埋纸盒和试验材料进行预热，预热温度为50℃。预热的作用是防止石蜡凝固影响后续的包埋操作，此外，在其他实施例中，可以根据环境温度自适应的进行预热或不进行预热。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述在进行切片前还包括对包埋处理的石蜡块进行修蜡，制得切面平整的试验材料蜡块，将试验材料蜡块切片，切片厚度为8-10μm。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述烤片具体包括如下步骤：将切片置于40-42℃下展片，用涂有粘片剂的载玻片进行捞片，再将附着有切片的载玻片置于43-45℃下烤片3-7d。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述脱蜡具体包括将烤片后的载玻片放入柠檬烯中浸泡25-35min，再将载玻片置于新的柠檬烯中浸泡10-12min。脱蜡处理的原理是柠檬烯与蜡的极性相近，蜡在柠檬烯中的溶解度大。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述脱蜡处理后还包括对载玻片进行复水处理，具体包括将载玻片依次放入体积比为0.8-1：1-1.2的乙醇与柠檬烯的混合溶剂、纯乙醇、体积分数为95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇和蒸馏水中，每个溶剂的浸泡时间为1-1.5min。通过设置梯度复水，有利于减少复水过程中对试验材料的损伤，尽可能保证制备的金针菇子实体组织切片能准确反映该生理状态的真实情况。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述复水处理后还包括染色步骤，具体包括将复水处理后的载玻片放入质量浓度为1％-1.2％的细胞壁染液中4-6h，然后依次放置于蒸馏水、体积分数为50％的乙醇、70％的乙醇、85％的乙醇、95％的乙醇和无水乙醇中，每个溶剂的浸泡时间为25-30s，最后放置于柠檬烯中处理2-3次，每次20-25min；优选的，细胞壁染液为甲苯胺蓝水溶液。此外，在其他实施例中，细胞壁染液包括但不限于甲基蓝，固绿，结晶紫，龙胆紫，亚甲蓝或美蓝，甲基绿，亚甲紫，橙黄G及酒石黄。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述染色处理后还包括封片步骤，具体包括将染色的载玻片在柠檬烯中沾湿后，用擦镜纸擦去载玻片底部和周本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备金针菇子实体组织切片的方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤，先将经脱水处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的混合液中进行初步透明处理，再将初步透明处理的金针菇材料浸泡于柠檬烯中进行二次透明处理；将经二次透明处理后的金针菇材料放入柠檬烯与液体石蜡混合液中进行初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料放入液体石蜡中进行二次浸蜡处理；然后将经二次浸蜡处理后的金针菇材料依次进行包埋处理，切片和烤片，将烤片处理的载玻片放入柠檬烯中浸泡脱蜡。

【技术特征摘要】
1.一种制备金针菇子实体组织切片的方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤，先将经脱水处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的混合液中进行初步透明处理，再将初步透明处理的金针菇材料浸泡于柠檬烯中进行二次透明处理；将经二次透明处理后的金针菇材料放入柠檬烯与液体石蜡混合液中进行初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料放入液体石蜡中进行二次浸蜡处理；然后将经二次浸蜡处理后的金针菇材料依次进行包埋处理，切片和烤片，将烤片处理的载玻片放入柠檬烯中浸泡脱蜡。2.根据权利要求1所述的制备金针菇子实体组织切片的方法，其特征在于，所述初步透明处理具体包括先将金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的体积比为0.8-1.2:1.8-2.2的溶液中处理25-35min，再将处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与乙醇染色液的体积比为1.7-2.3:0.9-1.1的混合液中染色处理25-35min，所述二次透明处理包括将染色处理后的金针菇材料在柠檬烯中处理1-3次，每次25-35min；优选的，所述初步透明处理具体包括先将金针菇材料浸泡于柠檬烯与纯乙醇的体积比为1:2的溶液中处理30min，再将处理后的金针菇材料浸泡于柠檬烯与乙醇染色液的体积比为2:1的混合液中染色处理30min，所述乙醇染色液为乙醇番红O染色液，所述乙醇番红O染色液的浓度为10g/L，所述二次透明处理包括将染色处理后的金针菇材料在柠檬烯中处理2次，每次30min。3.根据权利要求1所述的制备金针菇子实体组织切片的方法，其特征在于，所述柠檬烯为D-柠檬烯，L-柠檬烯或DL-柠檬烯中的任意一种，优选的，所述柠檬烯为D-柠檬烯。4.根据权利要求1所述的制备金针菇子实体组织切片的方法，其特征在于，所述初步浸蜡处理具体包括将二次透明处理后的金针菇材料放入柠檬烯中，在52-57℃下，每隔1.8-2.2h向柠檬烯中添加1-2g石蜡，当总的溶液体积达到柠檬烯体积的1.9-2.1倍时，停止添加石蜡，保温12h完成初步浸蜡处理，再将初步浸蜡处理后的金针菇材料置于新的液体石蜡中进行二次浸蜡处理，在58℃下保温处理3-4次，每次处理2...

【专利技术属性】
技术研发人员：万佳宁，王瑞娟，龚明，鲍大鹏，尚晓冬，汪莹，茅文俊，尚俊军，唐利华，杨慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31