一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用，所述HER2的引物如SEQ ID NO:1～6所示；所述HER2的探针如SEQ ID NO:7～9所示。本发明专利技术针对HER2基因设计引物和探针，与内参基因CEP17和GAPDH的引物和探针相互配合，根据HER2基因和内参基因的比例，对乳腺癌患者石蜡包埋病理切片组织DNA或外周血浆cfDNA的HER2基因扩增突变状态进行定量检测，为靶向用药提供了关键信息，具有绝对定量、检测周期短、高特异性、高准确性和高灵敏度等特点。

A HER2 Detection Kit and Its Detection Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术属于医学和生物
，涉及一种试剂盒及其检测方法和应用，尤其涉及一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，在女性患者中发病率和死亡率最高，近年来，我国乳腺癌患者的数量以3％～7％的速度持续增长。精准诊断和个体化治疗的开展可显著延长患者生存期、改善患者的生存质量并降低死亡率。人类基因组学研究发现，人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2)的扩增可以促使肿瘤细胞表面的HER2蛋白表达量上调，导致HER2主导的生长信号过度活跃，最终引发癌细胞恶性分化。研究发现，15％～20％的乳腺癌患者存在HER2基因扩增，与没有发生HER2基因扩增的乳腺癌患者相比，其恶性程度更高，发展进程更快，复发率更高，已转移，且生存期缩短。循环肿瘤DNA(ctDNA)是一类具有广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于基因分型，判断肿瘤发展状态和预后评价。ctDNA是游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)中的一种，最早应用于产前胎儿性别判断和唐氏综合征等发育性疾病的筛查。但是，关于外周血ctDNA与癌症的关系的研究，未有突破性进展，原因是ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。近年来研究发现，ctDNA在血液中的含量会随肿瘤的发展而变化，液体活检技术在超早期对血液中的ctDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断提供参考依据，是一次革命性的进步。HER2的检测标准为：标本首先进行免疫组织化学检测(IHC)，IHC积分为3+判读为HER2基因扩增，IHC积分为0或1+判读为无基因扩增(阴性)，IHC积分为2+需要采用荧光原位杂交(FISH)做进一步检测。IHC是一种半定量方法，检测结果需要有经验的技术人员进行鉴定，且检测结果受到环境、试剂、操作、主观判读等诸多因素的影响，从而出现同一份样品在不同的实验室或同一实验室不同时期的检测结果不一致的情况。另外，第17号染色体多体性也可能导致FISH结果假阴性，直接影响检测结果的可靠性。微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)作为第三代PCR技术，是基于传统PCR的一种全新的核酸分子定量方法，与实时荧光定量PCR相比，ddPCR无需构建标准曲线，不受扩增效率的影响，结果具有较高的精确度、准确性和灵敏度。微滴数字PCR技术的核心是将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，每个微滴中含有或不含一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，通过分析软件计算出待检靶分子的浓度和拷贝数，以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数。CN106591438A公开了一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用，所述核酸组合包括两对Her2基因引物和两对内参引物。本专利技术通过使用两对引物和两对内参使用数字PCR方法对Her2基因进行检测，能够对Her2基因进行绝对定量，借助软件完全自动化的进行结果判读，分析速度快。使用两对引物有利于提高检测结果的准确性，特别是对于血液这种本身DNA含量较低的样品。同时使用两对内参引物，减少了假阴性和假阳性的可能。但检测方法的准确性需要进一步提高。因此，提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简便、成本较低的HER2基因检测方法，在癌症治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用，所述试剂盒针对HER2基因设计引物和探针，与内参基因CEP17和GAPDH的引物和探针相互配合，简化了检测方法，提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种检测HER2的引物探针组合物，所述HER2的引物如SEQIDNO:1～6所示；所述HER2的探针如SEQIDNO:7～9所示；SEQIDNO:1所示的核苷酸序列为：CTCATCGCTCACAACCAAGT；SEQIDNO:2所示的核苷酸序列为：CAGGGCATAGTTGTCCTCAA；SEQIDNO:3所示的核苷酸序列为：CACAACCAAGTGAGGCAGGTC；SEQIDNO:4所示的核苷酸序列为：CGTATTGTTCAGCGGGTCTCC；SEQIDNO:5所示的核苷酸序列为：TGCATCGCTCACAACCAAGT；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为：CGTATTGTTCAGCGGGTCTC；SEQIDNO:7所示的核苷酸序列为：5’-6-FAM-TGTGCGAGGCACCCAGCTCT-MGB-3’；SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为：5’-6-FAM-TCCAGCTCTTTGAGGACAAC-MGB-3’；SEQIDNO:9所示的核苷酸序列为：5’-6-FAM-TTGCGGATTGTGCGAGGC-MGB-3’.本专利技术中，针对HER2基因设计引物和探针，对DNA进行数字扩增和检测，根据探针的荧光信号值进行数据分析，确保获得准确的HER2扩增信息，同时排除其他基因的干扰，保证了结果的准确性。优选地，所述HER2的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种。优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。第二方面，本专利技术提供了一种检测HER2的试剂盒，所述试剂盒包括检测HER2的引物探针组合物。优选地，所述HER2的引物如SEQIDNO:1～6所示。优选地，所述HER2的探针如SEQIDNO:7～9所示。优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针。优选地，所述内参基因包括CEP17和/或GAPDH。优选地，所述CEP17的引物如SEQIDNO:10～13所示；SEQIDNO:10所示的核苷酸序列为：GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTA；SEQIDNO:11所示的核苷酸序列为：TGGTGCTCAGGCAGTGC；SEQIDNO:12所示的核苷酸序列为：GCTATGGTAGAAAAGGAAATACTC；SEQIDNO:13所示的核苷酸序列为：AGTCAACAGGAATGTTCAAAT.优选地，所述CEP17的探针如SEQIDNO:14～15所示；SEQIDNO:14所示的核苷酸序列为：5’-HEX-TGCTGCAATAGGCGG-MGB-3’；SEQIDNO:15所示的核苷酸序列为：5’-HEX-TGACAGAATCATTATCAGAAACTAC-MGB-3’.优选地，所述GAPDH的引物如SEQIDNO:16～17所示；SEQIDNO:16所示的核苷酸序列为：CATCTTCCAGGAGCGAGATCCC；SEQIDNO:17所示的核苷酸序列为：ATGGTTCACACCCATGACGAACA.优选地，所述GAPDH的探针如SEQIDNO:18所示；SEQIDNO:18所示的核苷酸序列为：5’-HEX-GAGTACGTCGTGGAGTCCACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测HER2的引物探针组合物，其特征在于，所述HER2的引物如SEQ ID NO:1～6所示；所述HER2的探针如SEQ ID NO:7～9所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测HER2的引物探针组合物，其特征在于，所述HER2的引物如SEQIDNO:1～6所示；所述HER2的探针如SEQIDNO:7～9所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述HER2的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种；优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。4.一种检测HER2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测HER2的引物探针组合物；优选地，所述HER2的引物如SEQIDNO:1～6所示；优选地，所述HER2的探针如SEQIDNO:7～9所示。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针；优选地，所述内参基因包括CEP17和/或GAPDH；优选地，所述CEP17的引物如SEQIDNO:10～13所示；优选地，所述CEP17的探针如SEQIDNO:14～15所示；优选地，所述GAPDH的引物如SEQIDNO:16～17所示；优选地，所述GAPDH的探针如SEQIDNO:18所示；优选地，所述内参基因的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓妮，李慧，刘园园，许明炎，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：广东,44