DNA walker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法技术

本发明专利技术公开一种DNA walker信号放大构建MnO2‑UCNPs荧光共振能量转移分析方法。该方法利用核酸链置换反应和Mn

Construction of Fluorescence Resonance Energy Transfer Analysis Method for MnO 2-UCNPs by DNA Walker Signal Amplification

【技术实现步骤摘要】
DNAwalker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法
本专利技术涉及了一种DNAwalker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，属于纳米材料和生物传感分析

技术介绍
上转换纳米材料（UCNPs）能够将低能量的近红外光子转换成高能量的可见光，使其广泛应用于生物分析和生物医学领域。相对于传统的荧光染料，UCNPs不仅具有良好的发光效率和生物相容性，而且具有高效的光稳定性、低自体荧光、大的反Stokes位移，高信噪比等优异性能。二氧化锰（MnO2）作为二维过渡金属氧化物，由于其具有宽的吸收光谱和大表面积，而被用作高效的荧光猝灭剂。目前，以MnO2为荧光受体，UCNPs为荧光供体构建的荧光共振能量转移（FRET）传感方法已经引起科研工作者的不少关注。因此，本专利技术基于具有良好发展前景的MnO2-UCNPs的FRET传感体系进行生物领域的研究。DNAwalker是一种新兴的DNA分子机器，能够在预设的DNA轨道上精确移动，并作为优异的信号放大技术应用于生物传感分析方法。DNAwalker信号放大机制利用目标分子触发反应和特异的作用方式（如：支点调制的链置换、核酸调制的水解、DNAzyme介导的链剪切等）在DNA轨道上实现放大过程。比较一维和二维DNA分子轨道，三维轨道具有更高的迁移能力和富集效率。端粒酶作为一种核糖核酸蛋白复合物，以其特定的RNA为模板，通过逆转录作用催化端粒重复序列(TTAGGG)n到人类染色体的3'末端。大量研究表明，端粒酶能够用于癌症早期诊断、预后监控和癌症发病机理的了解。本专利技术以三维DNAwalker信号放大策略结合MnO2-UCNPs荧光共振能量转移（FRET）过程作为荧光信号传感平台，用于端粒酶活性的灵敏、特异性检测。利用端粒酶催化延伸反应启动DNAwalker在磁珠的3D轨道表面的行走过程。随着DNA自发行走过程中Mn2+依赖型的DNAzyme被不断识别剪切，触发链triggerDNA被不断释放生成。TriggerDNA利用其与UCNPs表面修饰的DNA链进行双链杂交互补作用，破坏MnO2-UCNPs的FRET过程，从而增强UCNPs的上转换荧光信号。因此，利用DNAwalker优异的信号放大能力，实现对端粒酶活性的高灵敏检测。
技术实现思路
基于以上背景，本专利技术的目的在于提供一种分析方法用于端粒酶活性的高灵敏检测。该方法利用核酸链置换反应和Mn2+介导DNAzyme剪切，实现三维DNAwalker信号放大过程，同时结合MnO2-UCNPs荧光共振能量转移的信号读出装置，显著放大荧光信号，从而实现对端粒酶活性的高灵敏检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：包括如下步骤：（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；（2）将双链DNAwalker支架序列（scaffoldstrand）和基底序列（substratestrand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNAwalker-MBs复合结构；（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP-UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2-UCNPs复合结构；（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于双链DNAwalker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNAwalker-MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，双链DNAwalker支架序列中Mn2+依赖型DNAzyme序列部分能够自由地与基底序列结合形成DNAzyme复合结构，Mn2+金属离子识别该结构的特定位点，并剪切释放TriggerDNA；生成的大量TriggerDNA与步骤（3）制得的MnO2-UCNPs复合结构进行孵育，由于CP序列与TriggerDNA杂交互补，MnO2-UCNPs结构破坏，UCNPs荧光信号恢复；在三维DNAwalker信号放大作用下，实现端粒酶活性的荧光定量检测。上述步骤（1）的具体制备方法为：NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备：将0.78mmolYCl3·6H2O，0.20mmolYbCl3·6H2O和0.02mmolTmCl3·6H2O的镧系金属盐加入含有7mL油酸和15mL的1-十八烯的100mL圆底烧瓶中，加热至150℃并在氮气环境中保持40min，溶液逐渐变成澄清透明；冷却至50℃，逐滴加入10mL含有4.0mmolNH4F和2.5mmolNaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟；随后，在100℃蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290℃并保持1.5h；反应结束，冷却至室温；合成的油酸包裹NaYF4:Yb,Tm上转换材料用乙醇清洗并分散于环己烷中；MnO2纳米片的制备：将含有0.6M四甲基氢氧化铵（TMA•OH）和浓度为3.0wt%的H2O2的20mL水溶液快速加入10mL0.3MMnCl2•4H2O，在15s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化；在2000rpm转速下离心15min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片；随后，25mgMnO2被重新分散在20mL水溶液，超声10h；再次在2000rpm下离心30min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液；利用ICP-OES法测得MnO2纳米片浓度为5mgL-1。上述步骤（2）的具体制备方法为：将含有1μMwalking链（walkingstrand）和1μMlocking链（lockingstrand）的5mMpH7.4Tris-HCl缓冲溶液中混合95°C退火3分钟，随后冷却至室温，形成双链DNAwalker支架序列；将亲和素修饰的磁珠（MBs）用5mMTris-HCl缓冲溶液洗涤，并重新分散于500μL5mMTris-HCl缓冲液，并加入500μL5nM双链DNAwalker支架序列和基底序列，混合孵育15min；利用磁性分离法将未连接作用于磁珠表面的序列去除；再者，将修饰成功的DNAwalker-MBs复合结构用缓冲溶液清洗3次，最后，DNAwalker-MBs复合结构重新分散于500μL5mM缓冲液，并在4°C保存。上述步骤（2）中所用的Tris-HCl缓冲液均为：含有0.5mMEDTA和1MNaCl的5mMpH7.4的Tris-HCl缓冲溶液。上述步骤（3）中CP的特定序列为：5'-TTTTTTTTATCGATTGGCCAGGTTAGCT-3'。上述步骤（3）中CP@UCNPs的制备和MnO2-UCNPs复合结构制备：将1.0mgOA-UCNPs重新分散于1.0mL0.1mMHCl超声1h，移除油酸（OA）配体；通过12000rpm离心0.5h，并用去离子水洗涤三次获得油酸配体去除的UCNPs，最后，配体去除的UCNPs重新分散于1.0mL去离子水；由100µL5.0µMCP序列和0.5mL油酸配体去除的UCNPs溶液混合搅拌24h；随后，甘油磷酸二钠盐水合物（GDSH）作为阻断剂加入上述溶液，最终浓度为100µM；在搅拌24h后获得CP@UCNPs，CP@UCNPs通过离心收集并用去离子水清洗三次；最后重新分散于含有50mMNaCl的10mMpH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA walker信号放大构建MnO2‑UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；（2）将双链DNA walker支架序列（scaffold strand）和基底序列（substrate strand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNA walker‑MBs复合结构；（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP‑UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2‑UCNPs复合结构；（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于双链DNA walker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNA walker‑MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，双链DNA walker支架序列中Mn

【技术特征摘要】
1.一种DNAwalker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）和MnO2纳米片；（2）将双链DNAwalker支架序列（scaffoldstrand）和基底序列（substratestrand）分别锚定于亲和素修饰的磁珠（MBs）上形成DNAwalker-MBs复合结构；（3）将特定DNA序列（CP）连接于UCNPs获得CP-UCNPs，利用CP序列与MnO2的吸附作用，构建MnO2-UCNPs复合结构；（4）利用端粒酶催化获得含(TTAGGG)n的延伸序列，该序列通过链置换作用于双链DNAwalker支架序列，驱动步骤（2）制得的DNAwalker-MBs复合结构；在磁珠三维轨道上，双链DNAwalker支架序列中Mn2+依赖型DNAzyme序列部分能够自由地与基底序列结合形成DNAzyme复合结构，Mn2+金属离子识别该结构的特定位点，并剪切释放TriggerDNA；生成的大量TriggerDNA与步骤（3）制得的MnO2-UCNPs复合结构进行孵育，由于CP序列与TriggerDNA杂交互补，MnO2-UCNPs结构破坏，UCNPs荧光信号恢复；在三维DNAwalker信号放大作用下，实现端粒酶活性的荧光定量检测。2.根据权利要求1所述的DNAwalker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（1）具体制备方法为：NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料（UCNPs）的制备：将0.78mmolYCl3·6H2O，0.20mmolYbCl3·6H2O和0.02mmolTmCl3·6H2O的镧系金属盐加入含有7mL油酸和15mL的1-十八烯的100mL圆底烧瓶中，加热至150℃并在氮气环境中保持40min，溶液逐渐变成澄清透明；冷却至50℃，逐滴加入10mL含有4.0mmolNH4F和2.5mmolNaOH的甲醇溶液，搅拌40分钟；随后，在100℃蒸发去除甲醇溶液，将混合液进一步加热至290℃并保持1.5h；反应结束，冷却至室温；合成的油酸包裹NaYF4:Yb,Tm上转换材料用乙醇清洗并分散于环己烷中；MnO2纳米片的制备：将含有0.6M四甲基氢氧化铵（TMA•OH）和浓度为3.0wt%的H2O2的20mL水溶液快速加入10mL0.3MMnCl2•4H2O，在15s内黑棕色溶液快速生成，并在室温下剧烈搅拌过夜，确保空气充分氧化；在2000rpm转速下离心15min，并用超纯水和甲醇多次清洗获得大量的MnO2纳米片；随后，25mgMnO2被重新分散在20mL水溶液，超声10h；再次在2000rpm下离心30min，去除残留的未剥落的MnO2，收集含有MnO2纳米片的上清液；利用ICP-OES法测得MnO2纳米片浓度为5mgL-1。3.根据权利要求1所述的DNAwalker信号放大构建MnO2-UCNPs荧光共振能量转移分析方法，其特征在于，步骤（2）具体制备方法为：将含有1μMwalking链（walkingstrand）和1μMlocking链（l...

【专利技术属性】
技术研发人员：许铭棣，庄君阳，唐点平，蒋晓瑜，
申请(专利权)人：福建工程学院，
类型：发明
国别省市：福建,35