一种连续发酵生产长链二元酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法，在发酵100‑150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。本发明专利技术的方法在不增加任何设备的基础上保证菌体长期活性，从而保证长链二元酸的持续生产，使得长链二元酸产率大幅度增加，得率也有所增加。

A Method for Producing Long Chain Dibasic Acids by Continuous Fermentation

The invention discloses a continuous fermentation method for producing long-chain dicarboxylic acid. After 100 to 150 hours of fermentation, the substrate is continuously fed and the solution containing nutrients is continuously fed. The method of the invention guarantees the long-term activity of the bacteria without adding any equipment, thereby ensuring the continuous production of long-chain dicarboxylic acid, greatly increasing the yield of long-chain dicarboxylic acid and increasing the yield of long-chain dicarboxylic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种连续发酵生产长链二元酸的方法
本专利技术涉及一种连续发酵生产长链二元酸的方法。
技术介绍
长链二元酸(LDCA，HOOC(CH2)nCOOH，n≥7)应用领域广泛，以其为原料可以合成特种尼龙(聚酰胺)、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。一般而言，长链二元酸可以用化学合成法或生物发酵法生产得到。化学合成方法合成路线长，反应条件严格，需要在高温高压条件下进行，并且对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上，以化学法合成的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。生物发酵法以长链烷烃为底物，通过微生物发酵转化得到长链二元酸；其生产过程在常温、常压条件下进行，并且可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。因此，长链二元酸的生物发酵法生产相较于化学合成法而言，其优势是不言而喻的。目前，针对生物发酵法生产长链二元酸已经有一定的研究基础。例如，研究初期，通过对油田中筛选得到的生产长链二元酸的菌株进行诱变来提高长链二元酸的产率；再例如，通过对长链二元酸合成过程中的关键酶(例如P450单加氧酶、FAO醇氧化酶、FaldDH醛脱氢酶等)的研究来提高长链二元酸的产率。国外对长链二元酸菌株的研究大多集中在对菌株进行基因改造，通过阻断或者弱化脂肪酸β氧化相关酶系，强化脂肪酸α-ω氧化酶系来提高产品的产率。在专利报道方面，CN91109895.X、CN98121084.8、CN200310104982.0、CN200410018255.7，CN200610029784.6都提供了微生物发酵生产长链二元酸的方法。专利CN201410065873.0与CN201410067073.2公布了利用膜分离菌体进行偶联发酵生产长链二元酸的技术。还有一些报道公开了串罐操作发酵生产长链二元酸的方法等。专利CN201510802343.4虽然公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置，但是其发酵液不仅需要增加膜过滤装置而且与种子罐进行偶联，通过定期补新鲜的种子液实现连续发酵过程，不仅增加了成本，而且增加了染菌风险。
技术实现思路
本专利技术提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法，本专利技术的方法在不增加任何设备的基础上保证菌体长期活性，从而保证长链二元酸的持续生产，使得长链二元酸产率大幅度增加，得率也有所增加。本专利技术的目的之一，一种连续发酵生产长链二元酸的方法，在发酵100-150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。以下对上述技术方案的进一步优选的技术方案，进行进一步说明。本专利技术的一个优选的技术方案，所述流加底物前，控制所述发酵液中底物含量为2％(v/v)以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。长链二元酸连续发酵的难点之一在于，如何保证在长时间的发酵过程中，保持菌体活性和持续产酸，并保证高的二元酸产酸速度、产量和得率。专利技术人经过大量研究，发现使用特定成分的含营养盐的溶液，能够实现很好的效果。由此得到本专利技术的一个优选的技术方案。本专利技术的一个优选的技术方案，所述含营养盐的溶液包括以下各成分：葡萄糖0.0％-1.0％(w/v)、玉米浆0.05％-0.15％(w/v)、酵母膏0.0％-0.3％(w/v)、磷酸二氢钾0.005％-0.015％(w/v)、尿素0.005％-0.015％(w/v)和硫酸铵0.01％-0.15％(w/v)，其余为水；所述百分比为质量体积比，即：各成分占溶液的质量体积比，发酵领域技术人员均知道，该质量体积比为g/100mL。另一方面，底物的流加速率和含营养盐的溶液的流加速率，对菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果，也有积极的作用，保证二者达到一定平衡，能够实现优异的效果。本专利技术的一个优选的技术方案，所述底物的流加速率和所述含营养盐的溶液的流加速率满足以下关系：0.3*V(底物)+18.5≤V(含营养盐的溶液)≤0.5*V(底物)+46其中，所述V(底物)为底物的流加速度，所述V(含营养盐的溶液)为含营养盐的溶液的流加速度。本专利技术的一个优选的技术方案，所述底物的流加速率V(底物)为2-5mL/L/h。本专利技术的一个优选的技术方案，所述含营养盐的溶液的流加速率V(含营养盐的溶液)为0.5-3mL/L/h。进一步的，稀释率对菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果，也有一定影响。在常规稀释率条件下，可以实现本专利技术的连续发酵生产长链二元酸的效果，如果对稀释率进行进一步的优化，则菌体活性和产酸量都会有更大的进步空间。本专利技术的一个优选的技术方案，所述发酵时的稀释率0.001-0.006h-1，优选0.0016-0.0054h-1。进一步，菌体浓度是影响菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果的另一个指标。在常规菌体浓度条件下，可以实现本专利技术的连续发酵生产长链二元酸的效果，如果对菌体浓度进行进一步的优化，则菌体活性和产酸量进一步增加。本专利技术的一个优选的技术方案，所述发酵所使用的菌株为热带假丝酵母，例如可以为：热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)菌株CATH1614，其保藏编号为CCTCCM2015303。本专利技术的一个优选的技术方案，所述底物包括C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。本专利技术的一个优选的技术方案，所述长链二元酸包括：化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7，包括但不限于：壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、十一碳二元酸(HOOC(CH2)9COOH，1,9-九碳二羧酸或1,11-十一碳二元酸，本专利技术中标记为“DC11”)、十二碳二元酸(HOOC(CH2)10COOH，1,10-十碳二羧酸或1,12-十二碳二元酸，本专利技术中标记为“DC12”)、十三碳二元酸(HOOC(CH2)11COOH，1,11-十一碳二羧酸或1,13-十三碳二元酸，本专利技术中标记为“DC13”)、十四碳二元酸(HOOC(CH2)12COOH，1,12-十二碳二羧酸或1,14-十四碳二元酸，本专利技术中标记为“DC14”)、十五碳二元酸(HOOC(CH2)13COOH，1,13-十三碳二羧酸或1,15-十五碳二元酸、本专利技术中标记为“DC15”)、十六碳二元酸(HOOC(CH2)14COOH，1,14-十四碳二羧酸或1,16-十六碳二元酸，本专利技术中标记为“DC16”)、十七碳二元酸(HOOC(CH2)15COOH，1,15-十五碳二羧酸或1,17-十七碳二元酸，本专利技术中标记为“DC17”)和十八碳二元酸(HOOC(CH2)16COOH，1,16-十六碳二羧酸或1,18-十八碳二元酸，本专利技术中标记为“DC18”)中的一种或多种。本专利技术的一个优选的技术方案，所述连续发酵方法中发酵液体积为发酵罐体积的50-80％。例如：使用30L发酵罐进行连续发酵时，通过底物和含营养盐的溶液的进料速率，以及出料速率，维持发酵罐中发酵液体积为15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种连续发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：在发酵100‑150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种连续发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：在发酵100-150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流加底物前，所述发酵液中底物含量为2％(v/v)以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含营养盐的溶液包括以下各成分：葡萄糖0.0％-1.0％(w/v)、玉米浆0.05％-0.15％(w/v)、酵母膏0.0％-0.3％(w/v)、磷酸二氢钾0.005％-0.015％(w/v)、尿素0.005％-0.015％(w/v)和硫酸铵0.01％-0.15％(w/v)，其余为水；所述百分比为质量体积比。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述底物的流加速率和所述含营养盐的溶液的流加速率满足以下关系：0.3*V(底物)+18.5≤V(含营养盐的溶液)≤0.5*V(底物)+46其中，所述V(底物)为底物的流加速度，所述V(含营养盐的溶液)为含营养盐的溶液的流加速度。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述底物的流加速率V(底物)为2-5mL/L/h；和/或，所述含营养盐的溶液的流加速率V(含营养盐的溶液)为0.5-3mL/L/h；和/或，所述发酵时的稀释率为0.001-0.006h-1，优选0.0016-0.0054h-1。6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述底物包括C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：路飞，徐敏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31