本发明专利技术公开了一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法。该方法包括以下步骤：步骤1，构建重组菌株E.coli BL‑22AB和E.coli BL‑YDT；步骤2，选取重组菌株E.coli BL‑22AB和E.coli BL‑YDT加入催化L‑赖氨酸反应生产戊二酸。与现有技术相比，本发明专利技术公开了一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，通过将DavAB和GabDT分开表达在两个细胞中，利用双细胞耦合催化生产的方式，使得中间产物5‑氨基戊酸的积累减少，终产物戊二酸的产量提高。相比于将DavAB和GabDT共表达在一个细胞中，戊二酸的摩尔收率提高了19.2%。
A Two-Cell Coupled Catalytic Method for Glutaric Acid Production
The invention discloses a method for producing glutaric acid by double cell coupling catalysis. The method consists of the following steps: step 1, construction of recombinant strains E.coli BL_22AB and E.coli BL_YDT; step 2, selection of recombinant strains E.coli BL_22AB and E.coli BL_YDT into catalytic L_lysine reaction to produce glutaric acid. Compared with the prior art, the invention discloses a method for producing glutaric acid by two-cell coupling catalysis. By expressing DavAB and GabDT separately in two cells, the accumulation of intermediate product 5 Compared with co-expression of DavAB and GabDT in one cell, the molar yield of glutaric acid increased by 19.2%.
【技术实现步骤摘要】
一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法
本专利技术涉及戊二酸制备
，具体涉及一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法。
技术介绍
戊二酸，别名：胶酸，α，γ一丙烷二竣酸，1，3一丙二竣酸，分子式为C5H8O4，是一种重要的有机化工原料和中间体，在化学、建筑、医药、农业等方面具有广泛的应用。在塑料工业中，戊二酸及其戊二酸烷基酯类主要作为增塑剂的中间体，是聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺以及聚氯乙烯的聚酯增塑剂的组成成分。在医药方面，戊二酸主要用于合成戊二酸酐，而戊二酸酐又可以作为很多药物的中间体，可用于合成新一代降血脂类药匹伐他汀和瑞舒伐他汀钙片。由于其良好的广谱杀菌能力，可以用来合成各种杀菌消毒洗液和医用药品等等。戊二酸也可合成液态聚酯，用于改良PET纤维的分子结构，从而改进PET纤维的染色性，提高上染率。利用戊二酸配制粘合剂可广泛粘接纺织品、金属等。此外，戊二酸或其酯也可用于聚酯多醇的合成、去垢剂的配制、含硫等烟道气的洗涤。合成戊二酸的传统方法有回收法，化学合成法。回收法生产戊二酸主要依赖从己二酸的副产物中分离提纯，此法操作繁琐流程长，回收率低且不稳定。合成法主要有环戊酮液相氧化法、，γ-丁内酯法、二氢吡喃法和戊二腈法。合成法大多原料昂贵不易得，试剂毒性大污染环境，产品收率低，合成路线复杂等缺点。SiJaePark等人采用过表达了davAB和GabDT的重组E.coliWL3110菌株，在含有赖氨酸，葡萄糖和α-酮戊二酸的培养基里共同发酵生产了1.7g/L戊二酸。此法发酵周期长且转化率低，且需要添加昂贵的α-酮戊二酸作为氨基受体，大大增加了生产成本。Jia-LeYu等人采用过表达了hgdH,、gctAB、hgdABC、ter和tesB的重组E.coli菌株，以α-酮戊二酸为底物厌氧培养得到了3.8mg/L戊二酸。此法反应体系复杂，原料昂贵且有副产物生成，戊二酸摩尔收率低。经检索，一种经济高效的双细胞耦合生产戊二酸的方法尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，该方法简单，催化效果好，且中间产物少。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，包括以下步骤：步骤1，构建重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT；步骤2，选取重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT混合后，催化L-赖氨酸反应生产戊二酸。作为改进的是，步骤1中重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT的构建方法，包括以下步骤：第一步，提取重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-GabTD，并以酶切位点NdeI进行酶切验证；第二步，将第一步中验证无误的重组质粒pET22b–DavBA导入E.coliBL21（DE3），得到重组菌株E.coliBL-22AB；第三步，将第一步中验证无误的重组质粒pACYC-GabTD导入E.coliBL21（DE3）中，得到重组菌株E.coliBL-YDT。作为改进的是，步骤2中重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT的OD比例为1：3。作为改进的是，步骤2中催化L-赖氨酸反应的温度为37℃，转速为200rpm。作为改进的是，步骤2中催化L-赖氨酸反应的pH为7.4。作为改进的是，步骤2中催化L-赖氨酸反应中还包括Cu2+。作为改进的是，步骤2中催化L-赖氨酸反应的底物浓度为20g/L。有益效果：与现有技术相比，本专利技术公开了一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，通过将DavAB和GabDT分开表达在两个细胞中，利用双细胞耦合催化生产的方式，使得中间产物5-氨基戊酸的积累减少，终产物戊二酸的产量提高。相比于将DavAB和GabDT共表达在一个细胞中，戊二酸的摩尔收率提高了19.2%。其次，通过对细胞比例的优化，解决了中间产物5-氨基戊二酸的积累问题，使得戊二酸的产量有了一定的提升，再者通过对催化体系的优化，筛选出最适温度，最适pH以及Cu2+,对酶的活性有进一步的提升。最后通过分批补料解决底物L-赖氨酸对酶活的抑制，最终得到了高效产戊二酸的方法。附图说明图1为E.coliBL-22AB-YDT细胞OD600=20单细胞与不同浓度L-赖氨酸的情况下催化产物的情况，（a）为戊二酸，（b）为底物L-赖氨酸，α-酮戊二酸以及中间产物5-氨基戊酸；图2为E.coliBL-22AB细胞OD600=20与E.coliBL-22AB-YDT细胞OD600=20在浓度为20g/L的L-赖氨酸下催化情况，5-氨基戊酸的积累情况；图3为E.coliBL-YDT细胞OD600=20与E.coliBL-22AB-YDT细胞OD600=20在5-氨基戊酸15g/L，α-酮戊二酸30g/L时，戊二酸的积累情况；图4为E.coliBL-22AB细胞OD600=10，E.coliBL-YDT细胞OD600=10双细胞耦合催化与E.coliBL-22AB-YDT细胞OD600=20单细胞催化，在L-赖氨酸20g/L时戊二酸的积累情况；图5为E.coliBL-22AB细胞OD600=10，E.coliBL-YDT细胞OD600=10，初始赖氨酸20g/L，多次补加赖氨酸高浓度母液后戊二酸和5-氨基戊酸的积累情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的专利技术方法进行详细描述和说明。其内容是对本专利技术的解释而非限定本专利技术的保护范围。实施例1重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的构建（1）重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-GabTD由本实验提供，质粒提取使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒进行质粒提取；（2）将提取出来的重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-GabTD以酶切位点NdeI经相对应的快速内切酶以最适温度酶切30min；（3）将（2）中的转化液取微量进行琼脂糖凝胶电泳验证，电压80v-120v，电泳15-30min，结束后，在透射紫外灯下观察成像；（4）将（3）中验证无误的重组质粒pET22b–DavBA导入E.coliBL21（DE3）中，并涂布在含有100mg/L氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coliBL-22AB；（5）将（3）中验证无误的重组质粒pACYC-GabTD导入E.coliBL21（DE3）中，并涂布在含有35mg/L氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coliBL-YDT；（6）将（3）中验证无误的重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-GabTD共同导入E.coliBL21（DE3），并涂布在含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coliBL-22AB-YDT。实施例2在大肠杆菌中共表达DavBA和GabDT催化生产戊二酸（1）从实施例1中的平板上挑取重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的100ml摇瓶里，37℃培养至OD600=0.6，加入0.5m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建重组菌株E.coli BL‑ 22AB和E.coli BL‑YDT；步骤2，选取重组菌株E.coli BL‑ 22AB和E.coli BL‑YDT混合后，催化L‑赖氨酸反应生产戊二酸。
【技术特征摘要】
1.一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT；步骤2，选取重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT混合后，催化L-赖氨酸反应生产戊二酸。2.根据权利要求1所述的一种双细胞耦合催化生产戊二酸的方法，其特征在于，步骤1中重组菌株E.coliBL-22AB和E.coliBL-YDT的构建方法，包括以下步骤：第一步，提取重组质粒pET22b–DavBA和pACYC-GabTD，并以酶切位点NdeI进行酶切验证；第二步，将第一步中验证无误的重组质粒pET22b–DavBA导入E.coliBL21（DE3），得到重组菌株E.coliBL-22AB；第三步，将第一步中验证无误的重组质粒pACYC-GabTD导入...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，苏芮，王昕，许晟，冯娇，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。