一种生物合成戊二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物合成戊二酸的方法，合成途径中包含5个酶，分别为：赖氨酸脱羧酶(cadA),戊二胺转氨酶(patA),5‑氨基戊酸半醛脱氢酶(patD),5‑氨基戊酸转氨酶(gabT)及戊二酸半醛脱氢酶(gabD)。将这些酶所编码的基因在宿主中表达，结果得到可以利用赖氨酸生产戊二酸的生产宿主。将上述基因导入赖氨酸高产菌株，实现了戊二酸的从头合成。同时本发明专利技术还公开了一种加强戊二酸生产的方法，是通过在工程菌中共表达戊二胺转运蛋白以及5‑氨基戊酸转运蛋白，促进胞外中间体向胞内转运，使得戊二酸的生产更为高效。本发明专利技术方法对于戊二酸的工业生产极具应用前景。

A Method for Biosynthesis of Glutaric Acid

The invention discloses a method for biosynthesis of glutaric acid, which comprises five enzymes: lysine decarboxylase (cadA), pentadiamine aminotransferase (patA), 5 aminopentanoic acid hemialdehyde dehydrogenase (patD), 5 aminopentanoic acid transaminase (gabT) and glutaric acid hemialdehyde dehydrogenase (gabD). The genes encoded by these enzymes were expressed in the host, and a production host for glutaric acid production using lysine was obtained. The above genes were introduced into lysine-producing strains, and the ab initio synthesis of glutaric acid was realized. At the same time, the invention also discloses a method for enhancing the production of glutaric acid by co-expressing glutamic diamine transporter protein and 5 1089 The method of the invention has great application prospect for the industrial production of glutaric acid.

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成戊二酸的方法
本专利技术涉及生物
，更确切的说，本专利技术涉及一种生物法生产戊二酸的方法，另外还涉及一种通过在工程菌中共表达戊二胺转运蛋白以及5-氨基戊酸转运蛋白，加速戊二酸生产的方法。
技术介绍
戊二酸(1,5-pentanedioicacid,Glutarate)是一种脂肪族二元羧酸，分子式是C5H8O4，分子量132.11，结构式：易溶于水、乙醇、乙醚等，在水中溶解度可达430g·L-1。在所有二元羧酸中，戊二酸的熔点最低，为95-98℃，这一良好的特性使其更适合用于尼龙-4,5和尼龙-5,5等重要聚合物的C5二羧酸结构单元。同时其也是1,5-戊二醇的前体，1,5-戊二醇是用作助焊剂活化剂和药物中间体的常用增塑剂。所以，戊二酸在药物和化工合成领域具有重要的应用价值。戊二酸的化学合成方法有很多种，工业上可从生产己二酸的副产品中回收，实验室可分别从γ-丁内酯、二氢吡喃、戊二腈、环己酮等作为底物，通过一系列化学反应制备而得。然而通过传统化学法合成戊二酸具有成本高、污染严重、操作条件要求高等缺点。现有的戊二酸生物合成途径也存在产量低、转化率低等缺点。因此开发新的戊二酸生物合成方法对于合成聚酰胺及聚氨酯等高分子聚合物具有十分重要的意义。本专利技术主要目的在于实现生物法制备戊二酸的高效合成。筛选了催化效率较高的酶来实现戊二酸的生产，同样人工设计了新的代谢途径实现了戊二酸的从头合成。另外本专利技术还公开了一种共表达戊二胺转运蛋白以及5-氨基戊酸转运蛋白的方法来加速戊二酸的生产。实验结果表明，在优化条件下，工程菌株利用赖氨酸或者葡萄糖在摇瓶中可产生3.74±0.06g/L和8.60±0.11g/L的戊二酸。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了高产戊二酸的宿主，通过在原始或改造过的细菌，真菌中过表达高效生产戊二酸途径中的酶，优选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA，5-氨基戊酸半醛脱氢酶patD，5-氨基戊酸转氨酶gabT及戊二酸半醛脱氢酶gabD，通过这些酶在宿主中的高效表达，实现戊二酸从赖氨酸的转化。本专利技术的另一个目的是选用戊二胺转运蛋白，5-氨基戊酸转运蛋白进行中间产物的转运调节，解决了中间产物在发酵液中大量积累而不能再一次被利用的问题，并取得了显著的效果。本专利技术的又一个目的是通过增强前体赖氨酸的合成，进而实现戊二酸的从葡萄糖这一简单碳源的高效合成。为了实现上述目的，本专利技术提供了能够产戊二酸的宿主，在原始或改造过的细菌，真菌细胞中过表达戊二酸合成路径中基因，制备所述的戊二酸的转化宿主。本专利技术还提供了微生物产戊二酸的方法：第一种是体外添加赖氨酸，向原始或改造过的细菌，真菌细胞中导入编码赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA,5-氨基戊酸半醛脱氢酶patD,5-氨基戊酸转氨酶gabT,戊二酸半醛脱氢酶gabD的基因，并进行发酵。从发酵液中取样，利用高效液相色谱对中间产物及目标产物的浓度进行了分析；第二种是戊二酸的从头合成，增强前体赖氨酸的合成，将产戊二酸的宿主过夜培养之后，转接到发酵培养基中，用高效液相色谱测定中间产物及目标产物的浓度。本专利技术还提供了微生物高产戊二酸的方法，具体有以下几种：第一通过模块化优化调节各个模块的表达强度，稳定并提高了戊二酸产量。第二是共表达戊二胺转运蛋白以及5-氨基戊酸转运蛋白进行中间产物的转运调节，加速中间产物由胞外向胞内转运，解决了中间产物胞外积累的问题，并取得了显著的效果。最终戊二酸体外添加及从头合成产量分别达到3.74±0.06g/L和8.60±0.11g/L。如上文所述，本专利技术涉及戊二酸的有效生产方法，所述方法的特征在于：通过在原始或改造过的细菌，真菌细胞中过表达高效生产戊二酸途径中的相关酶，共表达戊二胺转运蛋白以及5-氨基戊酸转运蛋白，从而实现戊二酸的高效从头合成。附图说明图1利用基因工程菌生产戊二酸作用机理示意图；图2模块化优化结果图；BM1:BW(pSA-cadA,pCS-patAD-gabTD)图3共表达戊二胺转运蛋白potE以及5-氨基戊酸转运蛋白gabP提高戊二酸产量结果图；BM2:BW(pSA-cadA-potE,pCS-patAD-gabTDP)图4利用基因工程实现戊二酸的从头合成；BM3:BW(pSA-cadA-potE,pCS-patAD-gabTDP,pZE-lysA-dapB-lysCfbr)具体实施方式以下结合附图与实施实例对本专利技术做进一步说明:本专利技术中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体，之后不再赘述。以下实施实例中，大肠杆菌菌株Trans5α,BW25113均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中Trans5α用于载体构建，BW25113则作为发酵用菌株。具体实施例1戊二酸生产菌株的模块化优化选择大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA,5-氨基戊酸半醛脱氢酶patD,5-氨基戊酸转氨酶gabT,戊二酸半醛脱氢酶gabD，PCR获得基因片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行双酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因分别插入到质粒pZE12-luc(高拷贝)，pCS27(中拷贝),pSA74(低拷贝)上。调节基因的表达量，检测目标产物及中间产物的积累情况，对宿主菌株进行了模块化优化，获得pSA-cadA,pCS-patAD-gabTD重组质粒(表1)。电转法制备感受态的细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于转化。将构建好的重组质粒pSA-cadA2μL以及pCS-patAD-gabTD2μL加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，加入LB培养基，并将混合物转移到1.5mL离心管中，复苏30-60min。之后将菌液涂到含有抗生素的平板上，37℃过夜培养。制备成生产戊二酸的菌株BM1:BW(pSA-cadA,pCS-patAD-gabTD)。模块化优化菌株的发酵在生产戊二酸的菌株BM1的平板上分别挑取单菌落，接到4mL的带有抗性的液体LB中，37℃下培养10h，之后分别将菌液转接到50mL的发酵培养基中，加入0.25-1mM的IPTG进行诱导，并添加底物赖氨酸。之后在12,24,48,72h时取样并用高效液相色谱测定中间产物及目标产物的浓度。最终产量如图2所示。具体实施例2共表达戊二胺转运蛋白potE,5-氨基戊酸转运蛋白gabP加速戊二酸合成选择大肠杆菌来源的potE,5-氨基戊酸转运蛋白gabP，PCR获得片段，接着用核酸内切酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因potE,gabP插入到质粒pSA-cadA及pCS-patAD-gabTD上，获得pSA-cadA-potE及pCS-patAD-gabTDP重组质粒(表1)。电转法制备感受态的细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于转化。将构建好的重组质粒pSA-cadA-potE及pCS-patAD-gabTDP各2μL加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀。接着利用电转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物合成戊二酸的方法，其特征在于：，合成路径所涉及的酶，包括赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA,5‑氨基戊酸半醛脱氢酶patD，5‑氨基戊酸转氨酶gabT,及戊二酸半醛脱氢酶gabD。

【技术特征摘要】
1.一种生物合成戊二酸的方法，其特征在于：，合成路径所涉及的酶，包括赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA,5-氨基戊酸半醛脱氢酶patD，5-氨基戊酸转氨酶gabT,及戊二酸半醛脱氢酶gabD。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，合成路径所涉及的酶来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造，编码赖氨酸脱羧酶cadA,戊二胺转氨酶patA,5-氨基戊酸半醛脱氢酶patD,5-氨基戊酸转氨酶gabT及戊二酸半醛脱氢酶gabD的基因。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生产途径的宿主，包括大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,谷氨酸棒杆菌,酿酒酵母，也包括改造过的细菌，真菌。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁其朋，孙新晓，李文娜，李向来，马琳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11