本发明专利技术公开了一种乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2及其用途，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因是红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中类胡萝卜素合成的关键酶基因，具有乙酰辅酶A乙酰转移酶的功能，能够调控红冬孢酵母YM25235产类胡萝卜素；通过基因工程手段对微生物进行改造，来提高微生物体内类胡萝卜素的产量，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。
Acetyl CoA Acetyltransferase Gene RKAcaT2 and Its Application
The invention discloses an acetyl coenzyme A acetyltransferase gene RKAcaT2 and its application. Its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1, and the amino acid sequence encoded by the gene is shown as SEQ ID NO:2. The gene is a key enzyme gene for carotenoid synthesis in Rhodosporidium kratochvilovae YM25235, and has the function of acetyl coenzyme A acetyltransferase. It can regulate the production of carotenoids by Rhodospora yeast YM25235, and improve the production of carotenoids in microorganisms by genetic engineering, laying a foundation for large-scale commercial production of carotenoids.
【技术实现步骤摘要】
乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2及其应用
本专利技术属于生物
和遗传工程领域，涉及一种乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2，具体涉及从酵母---红冬孢酵母（Rhodosporidiumkratochvilovae）YM25235中克隆的乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2以及将该基因直接与不同载体连接，转入酵母细胞，来提高这个基因的表达水平并最终促进类胡萝卜素的合成。
技术介绍
类胡萝卜素（carotenoid）是所有光合生物及一些非光合原核生物和真菌合成的亲脂性天然色素，在自然界中广泛存在，一般呈黄色、橙红色、红色或紫色，典型的类胡萝卜素是由8个异戊二烯单元首尾相连而成的C40萜类化合物及其衍生物，其结构中的共轭双键的作用导致其各种类胡萝卜素的颜色差异。一些类胡萝卜素侧碳链较短（C30）或较长（C45或C50），根据结构中是否含有氧官能团分为碳氢类胡萝卜素和含氧衍生物叶黄素。由于其分子结构中类异戊二烯宫二结构的存在，吸光性较强，所以一般在波长430～570nm之间有吸收峰。到目前为止，自然界已有700多个种类的类胡萝卜素被发现。天然类胡萝卜素对于生物体具有十分广泛的作用。首先，天然类胡萝卜素具有超氧自由基阴离子介导的抗氧化性质；防紫外线的光保护性能；调节细胞分化、细胞周期和凋亡等。在工业上类胡萝卜素被用作食品着色剂、营养强化剂和抗氧化剂等。叶黄素可作为食品着色剂用于面条、色拉调味品等食品中；在一些调味品中，利用番茄红素具有超强的抗氧化活性，代替亚硝酸盐防止食物腐败变质，有效的延长了保质期。由于大部分动物不能合成类胡萝卜素，需要从食物中获取，且人工合成的类胡萝卜素不具有这些特殊的生理功能，因而天然类胡萝卜素的制备相当重要。随着对天然类胡萝卜素制品的需求增加，尽管已有许多研究者对如何提高类胡萝卜素的产量进行了相当多的研究，但现在类胡萝卜素的产量和质量仍不能满足市场需求。目前，类胡萝卜素的生产方法主要包括植物提取法、化学合成法和生物合成法。化学合成法生产类胡萝卜素相较于其他方法而言，是成本最低且简便的，但由于存在生物活性低且生成色素有一定的毒副作用，已被许多国家和地区限制使用；植物提取法由于植物中类胡萝卜素含量较低，提取成本比较高、工艺又复杂等原因，使用也较少；而生物合成法提取的类胡萝卜素是纯天然的，对人体安全无毒副作用，因此用生物合成法提取类胡萝卜素是目前最具发展潜力的一种提取方法。微生物发酵生产类胡萝卜素只需要低成本天然底物作为碳源，该方法还具有生物培养周期短、产量高等特点，且微生物发酵生产类胡萝卜素不存在由于季节性和地域性变化而导致的产量和市场问题，目前来说，能够发酵产生类胡萝卜素的微生物主要有真菌、细菌和酵母菌等，其中利用酵母发酵生产类胡萝卜素的研究最为常见，且酵母属于我国饲料行业中确认的饲用微生物。因此，用微生物发酵法来替代其他方法可以从一定程度上缓解天然类胡萝卜素的生产发展局限，该方法将有助于实现发酵生产类胡萝卜素产品的工业化。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2，该基因是从红冬孢酵母（Rhodosporidiumkratochvilovae）YM25235中分离得到，该基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQIDNO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1191bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的多肽或其片段。本专利技术另一目的是提供一种含有乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2的重组表达载体，是将SEQIDNO:1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体；这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等；所述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。本专利技术另一目的是提供一种含有乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2或上述重组表达载体的宿主细胞。本专利技术的DNA片段序列也能用下列方法获得：（1）从基因组DNA分离双链DNA序列；（2）化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。本专利技术另一目的是上述乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2应用在产类胡萝卜素中。本专利技术从红冬孢酵母（Rhodosporidiumkratochvilovae）YM25235的总RNA基因中分离得到乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2，该基因全长1191bp；红冬孢酵母YM25235中RKAcaT2基因的过表达会引起细胞内这个基因的转录水平在一定程度上有一定的提高，说明外源基因在菌体内发生转录，继而翻译成相应蛋白，引起细胞内与类胡箩卜素合成相关的酶的表达量的提高。本研究结果有助于阐明红冬孢酵母YM25235中产类胡萝卜素机制，为揭示微生物提高类胡萝卜素产量机制提供参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高类胡萝卜素含量，对类胡萝卜素的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。附图说明图1为本专利技术的红冬孢酵母YM25235的RKAcaT2基因PCR扩增图；图2为重组质粒pRHRKAcaT2的质粒图谱；图3为重组质粒pRHRKAcaT2限制性酶切分析；其中：1、DNA分子量标记DL100002、空质粒pRH2034的NocⅠ、EcoRⅤ双酶切；3、重组质粒pRHRKAcaT2的NocⅠ、EcoRⅤ双酶切；4、RKAcaT2基因的PCR产物；5、DNA分子量标记DL2000；图4重组质粒pRHRKAcaT2转化红冬孢酵母YM25235阳性克隆验证；1.DNA分子量标记DL5000；2.野生型菌株特异性基因条带；3.重组菌株特异性基因条带；4.特异性基因的cDNA条带；5.DNA分子量标记DL2000；图5为过表达菌株YM25235/pRHRKAcaT2与对照菌株YM25235/pRH2034的总类胡萝卜素含量。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例1：从红冬孢酵母（Rhodosporidiumkratochvilovae）YM25235中分离乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2的核苷酸序列采用生工生物工程（上海）股份有限公司的UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（产品编号:SK1321）提红冬孢酵母YM25235的总RNA，然后按照TaK本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乙酰辅酶A乙酰转移酶基因
【技术特征摘要】
1.一种乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因编码的氨基酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，张晓庆，魏云林，林连兵，季秀玲，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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