一种体外培养戊型肝炎病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外培养戊型肝炎病毒的方法，该方法采用MDCK细胞对戊型肝炎病毒进行体外培养，利用RT‑nPCR、PT‑qPCR和免疫共聚焦的方法证实戊型肝炎病毒能够在MDCK细胞中大量复制，且能够稳定传代10代以上，该方法在戊型肝炎病毒体外培养方面有了大的突破，为进一步研究戊型肝炎病毒的生物学及免疫学特性，HEV感染及致病机制奠定了良好的基础。

A method of culturing hepatitis E virus in vitro

The invention discloses a method for culturing hepatitis E virus in vitro. The method adopts MDCK cells to culture hepatitis E virus in vitro, and uses RT_nPCR, PT_q PCR and immunoconfocal method to confirm that hepatitis E virus can replicate in large quantities in MDCK cells and can stably pass on for more than 10 generations. The method has made a great breakthrough in the field of hepatitis E virus culture in vitro. It laid a good foundation for further study on the biological and immunological characteristics of hepatitis E virus, and the infection and pathogenesis of HEV.

【技术实现步骤摘要】
一种体外培养戊型肝炎病毒的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种戊型肝炎病毒在体外成功培养并连续复制的新方法。
技术介绍
戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV）是一种经肠道传播的病毒性肝炎病原体，可以跨种间感染人和多种动物。HEV为单股正链RNA病毒，目前研究发现其主要有8种基因型（HEV-1---HEV-8），在中国主要流行基因4型HEV毒株（HEV-4）。现已证实HEV传播途径主要为粪--口途径，也可通过其他途径传播，如血液传播，接触传播，垂直传播，以及器官移植进行传播。HEV感染一般为急性自限性感染，患者在4-6周可自行排毒结束后康复。但对于免疫缺陷病人及老年人极易发展为慢性肝炎，并迅速发展为肝硬化和肝癌。据世界卫生组织统计，全球每年约有2000万人感染HEV，造成约7万人死亡。此外孕妇感染HEV致死率可高达25%，且常发生胎儿早产，流产，死胎及孕妇产后急性肝坏死等症状。戊型肝炎的防控形势已经迫在眉睫，发展有效的戊型肝炎疫苗已成为关系公众健康的急为紧迫的问题，而在这一过程中病毒培养至关重要。病毒培养是研究病毒生物学特性，致病机理及疫苗研制的基础。一直以来，HEV的体外培养都是研究的热点和难点，但由于HEV不能在体外高效复制，严重阻碍了病毒复制机制的研究，进而阻滞了HEV疫苗的研发。虽然目前已经利用A549和PLC/PRF/5细胞系成功建立了HEV细胞培养体系。但是还存在很多问题。一方面，目前建立的细胞培养体系所用细胞系均为癌细胞系，不能真实的反应正常机体感染HEV后的相关症状，更不能采用癌细胞系进行HEV疫苗的研发与生产。另一方面在使用现有的细胞培养体系时必须要接种较高滴度的病毒（108拷贝/mL）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养。基于HEV细胞培养体系的不足，为了必须建立一种高效且稳定的HEV体外培养体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效稳定的戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV）在体外培养的方法，该方法采用MDCK细胞对HEV毒株进行体外培养，发现病毒能够在MDCK细胞中大量复制，且能够连续传代10次以上，为深入研究HEV致病性以及疫苗的研发提供有效的体外实验模型。本专利技术戊型肝炎病毒体外培养方法，采用如下步骤进行：（1）将HEV病毒悬液依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌后，加入病毒悬液体积2～5%的双抗溶液，4～8℃处理2～3h，液氮中保存备用，经Real-timeqPCR测定其病毒拷贝数为2.4×104～3.3×105拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素的溶液；（2）将MDCK细胞按1.8×105～2×105/mL接种至10cm3的细胞培养瓶，用含体积百分比10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；（3）按每瓶0.8～1mL的接种量，将步骤（1）HEV病毒悬液接种至步骤（2）单层细胞中，置于35～37℃下孵育2～3小时，每15～30min轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；2～3小时后加入含体积百分比2%～5%胎牛血清的DMEM培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/LMgCl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养；（4）接种HEV病毒后每天观察MDCK细胞是否出现病变现象，当MDCK细胞出现80%-85%病变现象后，反复冻融，收集病变细胞及培养液，-80℃保存待用。（5）采用上述培养方法发现MDCK细胞可以支持戊型肝炎病毒体外培养并且可以连续传代10代以上，且使病毒复制效率增加至8.0×105拷贝数/mL。目前公开文献中虽然有关于HEV细胞培养体系建立的报道，但这些已公开的细胞体系均采用癌细胞系，而且采用现有的细胞培养体系进行HEV体外培养时必须要接种较高滴度的病毒（108拷贝/mL）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养；另外癌细胞系不能用于HEV疫苗的研发与生产。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：（1）本专利技术采用MDCK细胞，能够在体外连续传代培养；（2）本专利技术采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，可以大量检测到HEV抗原，证实MDCK细胞可以支持HEV体外复制；（3）本专利技术采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，在连续10代以上细胞悬液中均能够检测到HEVRNA，且具有较高的病毒拷贝；（4）本专利技术采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，在后代细胞悬液中检测到高于接种量的病毒拷贝，证实MDCK细胞可以支持HEV的复制；（5）本专利技术采用MDCK细胞体外培养HEV，后期可用于HEV疫苗研发与生产。附图说明图1是本专利技术中RT-nPCR检测培养上清中HEVRNA示意图；其中1为未感染的MDCK细胞；2为HEV感染的MDCK细胞；图2是本专利技术中RT-qPCR检测连续培养10代的培养上清中HEV病毒拷贝示意图；图3是本专利技术中使用的MDCK细胞感染HEV的免疫共聚焦示意图；其中上排图为正常MDCK细胞，下排图为HEV感染24小时后的MDCK细胞。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本专利技术，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。实施例1：MDCK细胞体外培养戊型肝炎病毒1、自液氮中取出MDCK细胞（购买于美国ATCC）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，转移至10cm3细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清的DMEM培养液（购买于GIBCOInvitrogenCorporation公司），于37℃培养，待长成致密单层后，用PBS（购买于GIBCOInvitrogenCorporation公司）洗细胞，胰酶-EDTA（购买于GIBCOInvitrogenCorporation公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养；2、将收集到的用于HEV分离的HEV阳性粪便制备重量体积比10%的PBS（pH7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10分钟，收集上清，依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积2%的双抗溶液（400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素）4℃处理3h，液氮中保存备用，经Real-timeqPCR测定其病毒拷贝数为2.4×104拷贝数/mL，分离自中国云南昆明市HEVRNA阳性猪粪便样品，基因型为4型；3、将实施例1中细胞（MDCK细胞）按2×105/mL接种至10cm3细胞培养瓶中，用含体积百分比10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每个细胞培养瓶加1mLHEV病毒悬液，置于37℃孵育2h，每隔30分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，2小时后加入含体积百分比2%胎牛血清的DMEM培养基，同时添加终浓度为0.01m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外培养戊型肝炎病毒的方法，其特征在于：采用MDCK细胞对戊型肝炎病毒进行体外培养。

【技术特征摘要】
1.一种体外培养戊型肝炎病毒的方法，其特征在于：采用MDCK细胞对戊型肝炎病毒进行体外培养。2.根据权利要求1所述的体外培养戊型肝炎病毒的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将HEV病毒悬液依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌后，加入病毒悬液体积2～5%的双抗溶液，4～8℃处理2～3h，液氮中保存备用，经Real-timeqPCR测定其病毒拷贝数为2.4×104～3.3×105拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素的溶液；（2）将MDCK细胞按1.8×105～2×105/mL接种至10cm3的细胞培养瓶，用含体积百分...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄芬，郝先辉，禹文海，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53