本发明专利技术涉及一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供了上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因和关键性氨基酸构成以及应用。本发明专利技术获取了羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的详细结构特征，对B2L蛋白的关键性氨基酸进行分析，将有助于今后开发羊口疮基因工程疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子生物学领域，涉及一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L及其应用。
技术介绍
羊口疮病毒(orfvirus,ORFV)是痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)中的成员，在副痘病毒属中还包含假牛痘病毒(PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)和新西兰的马鹿病毒(PNZV)等，均与羊口疮病毒类似。典型的ORFV粒子外部有囊膜包裹，类似橄榄球形状，病毒粒子长230～290nm，宽140～200nm。电子显微镜观察下，可见羊口疮病毒粒子表面呈特征性的编织螺旋样结构相互交叉排列，围绕病毒粒子的长轴作“8”字形缠绕。羊口疮病毒粒子存在两种不同形态，第一种是细胞内成熟病毒(Intracellularmaturevirus,IMV)，该类型病毒表面不存在囊膜结构；另一种为细胞外包膜病毒(Extracellularenvelopedvirus,EEV)，这种类型的病毒具有囊膜结构。IMV型病毒粒子大多呈现上尖下宽的结构，表面没有特殊结构，IMV型病毒粒子可以由EEV型病毒粒子在有机溶剂或者在碱性溶液中脱去表面囊膜结构而形成。并且发现人工感染的病羊病变组织中，IMV型颗粒占多数，而自然发病的羊，病料中IMV型粒子仅占有少数，EEV型粒子则占多数。由于ORFV的生存能力较强，很难彻底清除羊群中存在的病毒。ORFV基因组中的第11号基因为B2L基因，位于病毒基因组的保守区，该基因全长1137bp，编码蛋白质大小为42kDa，该基因的G+C含量约为63.6％。但是不同毒株的B2L蛋白也有一些小的差异，B2L基因编码的379个氨基酸中，可能有5～12个氨基酸出现差异。国内外常利用B2L基因的稳定性来分析比较各个毒株的同源性以及构建进化树，也利用该基因通过PCR检测病毒。从分子水平了解毒株间亲缘关系以及变异情况。ORFV011(B2L)基因在病毒DNA开始复制后即活跃地开始翻译。42kDa蛋白是病毒囊膜的主要成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并能引起淋巴细胞增殖。1994年，Sullivan等通过氨基酸同源性分析发现，ORFV的B2L蛋白不仅与VACEEV的p37K囊膜蛋白高度同源，还与FPV和MCV的p43k蛋白具有较高的同源性，因此推测ORFV的B2L蛋白为病毒囊膜主要成分之一，是研究病毒与宿主细胞相互作用、结合的重要蛋白。目前，基因工程疫苗已经成为国内外羊口疮新型疫苗研究的主要方向，并取得了多方面的进展。Sullivan曾报道ORFV产生IgG的囊膜蛋白为42kDa(B2L)，免疫羔羊能够产生较好的免疫原性，为羊口疮亚单位疫苗和基因工程疫苗设计的构建了雏形。国外一些研究者正着手用B2L基因与病毒囊膜亚单位中的其它保护性抗原基因进行重组，有望获得优良的基因工程苗。我国基因疫苗研究仍滞后于国外，主要表现在基础研究薄弱，自主知识产权产品较少，原始创新能力有待加强。单克隆抗体保护性表位作图及功能性氨基酸残基的鉴定，对于确定表位疫苗的候选成分至关重要。1997年Czerny等利用ORFV突变株ORFV-D-1701株单抗通过竞争ELSIA鉴定出3个不同的抗原位点，其中一株单抗(IgM)能够中和病毒感染；同时确定其单抗针对39kDa和22kDa两种病毒表面蛋白。1998年Housawi等从28株针对CEV-F1L的单抗中获得1株可以识别8种副痘病毒的共享性单抗，预示该单抗所识别的抗原表位位于病毒基因组的保守区。我们通过B2L蛋白的中和性单抗2E4的B细胞构象型抗原表位精确作图，发现其表位的天然组成及关键性氨基酸残基，综合若干ORFV的T细胞表位，为研发羊口疮多表位DNA重组疫苗积累了数据。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的氨基酸序列。本专利技术的第二目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因。本专利技术的第三目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物。本专利技术的第四目的是提供上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的中和性构象表位的关键性氨基酸构成。本专利技术的第五目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的应用。本专利技术通过以下技术方案来实现：一、一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。二、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。三、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物，序列如下：F:CCAAAGCTTTACATAATCGGGGTTGCC(SEQIDNo.3)，R:CCGAATTCTCACACGATGGCCGTGACC(SEQIDNo.4)。四、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的中和性构象表位的关键性氨基酸残基为N56、Q87和D94。五、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L在制备治疗羊口疮药物中的应用。具体的，根据GenBank中羊传染性脓疱病毒(ORFV)标准株ORFV-NZ2(NCBIAccession:DQ184476)的DNA参考序列，设计囊膜蛋白B2L基因的特异性引物，以黑龙江流行株OV/HLJ/04提取的DNA为模板，通过PCR扩增，获得B2L基因。将B2L基因克隆于pMD18-T载体中，转化至DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性克隆送上海生工进行测序，根据测序结果进一步分析B2L产物：同源序列比对；分子进化分析；抗原特性分析；同源建模等。B2L中和性构象表位作图，采取了综合性方法。首先通过饱和硫酸铵法和pro.G柱法纯化单抗2E4，进而针对2E4识别的模拟表位基序进行了生物淘选。采用噬菌体随机展示肽库技术获得10株阳性DNA突变体，通过阳性克隆之间的测序、比对，获得其模拟表位基序为VKVNPPQYDLxx(x代表任意氨基酸残基)。经与GeneBank中公开的ORFV同源基因氨基酸序列比对，推断2E4表位为构象型表位；继而，根据B2L分子同源建模在线搜索结果，结合DNAStar预测数据，将B2L蛋白分为前55aa残基、中31aa残基以及后38aa残基三个区段进行原核表达。通过Westernblot分析验证，将2E4表位定位于前55aa残基区段内。第三，确定2E4构象表位中关键性的氨基酸残基。根据同源建模的3D模型，在表位相关区域内选择K61、K69、K75、D94、E95和L96共6个疑似目标氨基酸，利用分丙氨酸扫描法构建突变重组质粒pGEX-6p-1-n(n代表6个不同位置的目标残基)，表达，纯化，Westernblot验证。结果发现D94位置取代后，使2E4与B2L蛋白反应能力显著下降，而其它氨基酸的替换对于B2L结合影响不大，而共同突变K61、E62、D92、D94成丙氨酸后，使B2L蛋白与2E4反应几乎完全丧失，从而证明D94为2E4表位的关键性氨基酸。根据综合分析结果，判定2E4表位的功能区依赖于N56、Q87和D94等共同维系的空间构象。采用上述技术方案的积极效果：本专利技术获取了羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的详细结构特征，对B2L蛋白的关键性氨基酸进行分析，将有助于今后开发羊口疮基因工程疫苗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求2所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物，序列如下：F:CCAAAGCTTTACATAATC...
【专利技术属性】
技术研发人员：于永忠，赵文博，张雪，谭强，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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