一种二萜类化合物、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种新的萜类化合物及其制备方法和应用，所述萜类化合物是由小单孢菌Micromonospora sp.HM134经发酵培养，然后通过提取分离得到的天然化合物，该类萜类化合物具有良好的抗肿瘤活性。

A diterpenoid compound, its preparation method and Application

The invention discloses a new terpenoid compound and its preparation method and application. The terpenoid compound is a natural compound obtained by fermentation and culture of Micromonospora sp. HM134, and then extracted and separated. The terpenoid compound has good anti-tumor activity.

【技术实现步骤摘要】
一种二萜类化合物、其制备方法及其用途
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种新的二萜类化合物、其制备方法及其抗肿瘤活性的用途。
技术介绍
萜类化合物是由异戊二烯结构单元相连而成的化合物。在生物体内，异戊二烯可以头头相连、头尾相连等方式，以不同数目链接，再加上各种不同基团的修饰，构成了结构多样性的一类天然产物。萜类具有广泛的生理活性，包括细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌、杀线虫、杀疟原虫、止痛、抑制血小板凝集、降压、调节心律失常等。陆地萜类化合物主要来源于植物，多以树脂、内酯或苷等形式存在。由于海洋环境中次级代谢产物合成途径的不同，海洋萜类具有不同于陆地来源的结构。海洋萜类化合物是海洋天然产物中最大的一类化合物，几乎达海洋天然产物的1/3以上，在各种海洋生物中都可以找到，目前报道主要存在海洋植物、海洋无脊椎动物海绵和珊瑚等中。从植物中提取该类物质涉及资源限制、工艺复杂等多重问题，并最终阻碍了该类化合物的应用，因此在海洋微生物中发现该类资源具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的二萜类化合物，其分子结构如式(I)所示：本专利技术还提供了制备式(I)二萜类化合物的方法，该方法是以小单胞菌为出发菌株，发酵生产该二萜类化合物，然后经过提取分离得到二萜类化合物。进一步地，所述发酵生产所用的发酵培养基包含碳源和氮源，其具体产生菌为小单孢菌Micromonosporasp.HM134，菌种保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.15401。进一步地，制备式(I)二萜类化合物的方法，包括以下步骤：(1)在包含碳源和氮源的培养基中发酵培养小单孢菌(Micromonosporasp.HM134，其保藏编号为CGMCCNo.15401)，并收集发酵液；(2)将步骤(1)收集得到的发酵液，分离得到菌丝体和上清液，菌丝体经过有机溶剂A提取得到提取液；上清液经树脂吸附，然后用有机溶剂B洗脱得到洗脱液；合并提取液和洗脱液，得合并液；(3)将步骤(2)所得合并液，依次经过浓缩、萃取、浓缩、硅胶柱层析、凝胶柱层析后得到含有二萜类化合物的流分样品；(4)将步骤(3)中得到的流分样品进行反相柱层析得到二萜类化合物。本专利技术所涉及的菌株Micromonosporasp.HM134系从福建红树林采集的海水样品中分离得到的一株产二萜类化合物的小单孢菌。该菌于2018年02月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为：CGMCCNo.15401，分类命名为小单孢菌Micromonosporasp.，并登记入册，证明存活。上述方法中，其中步骤(1)中所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、工业糖蜜、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、麦芽糖、木聚糖或它们的组合，优选为可溶性淀粉与葡萄糖组合；所述的氮源选自酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、大豆粉、花生饼粉、棉籽饼粉、麦芽抽提物、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆干粉、麸皮、麸质粉、尿素、铵盐或它们的组合，优选为黄豆饼粉、酵母抽提物、麦芽抽提物或它们的组合。上述方法中，其中步骤(2)中所述树脂为大孔吸附树脂，优选为HP-20大孔吸附树脂，所述有机溶剂A选自低级酮、C1-C3醇或它们的混合物，优选自丙酮、甲醇、乙醇或者它们中的两种或多种的组合；所述有机溶剂B选自低级酮、C1-C3醇或它们的混合物，优选自丙酮、甲醇、乙醇或者它们中的两种或多种的组合。上述方法中，其中步骤(3)中所述的硅胶柱层析所使用的硅胶粒径选自100-200目，所述硅胶柱层析所使用的洗脱溶剂为C5-C8烷烃和脂肪酸酯的混合溶剂系统，所述硅胶柱层析所使用的洗脱方式优选为梯度洗脱；进一步地，所述C5-C8烷烃优选自正庚烷、正己烷或它们的混合物，所述脂肪酸酯优选为乙酸乙酯。作为进一步的优选方案，其中步骤(3)中所述硅胶柱层析所使用的洗脱方式为正庚烷:乙酸乙酯＝100:0-80:20(V/V)梯度洗脱；或为正己烷:乙酸乙酯＝100:0-80:20(V/V)梯度洗脱。上述方法中，其中步骤(3)中所述的凝胶柱层析所使用的凝胶为凝胶LH-20，所述凝胶柱层析所使用的洗脱溶剂为氯代烷烃和C1-C3醇的混合溶剂系统，所述凝胶柱层析所使用的洗脱方式优选为等度洗脱；所述氯代烷烃优选自氯仿、二氯甲烷或它们的混合物，所述C1-C3醇优选甲醇、乙醇或它们的混合物。作为进一步优选方案，其中步骤(3)所述凝胶柱层析所使用的洗脱溶剂为氯仿:甲醇系统(90:10-10:90，V/V)或二氯甲烷:甲醇系统(90:10-10:90，V/V)；优选为氯仿:甲醇＝50:50(V/V)或者二氯甲烷:甲醇＝50:50(V/V)。上述方法中，其中步骤(4)中所述的反相柱层析所采用的反相层析柱为反相C18柱，所述反相柱层析所使用的洗脱溶剂选自乙腈、甲醇、乙腈的水溶液、甲醇的水溶液或者甲醇与乙腈的混合溶剂的水溶液；优选地，所述乙腈的水溶液中乙腈与水的体积比＝20:80-100:0，所述甲醇的水溶液中甲醇与水的体积比＝20:80-100:0，所述甲醇与乙腈的混合溶剂的水溶液中甲醇与乙腈的混合溶剂与水的体积比＝20:80-100:0，更优选乙腈的水溶液中乙腈与水的体积比＝25:75-90:10，甲醇的水溶液中甲醇与水的体积比＝25:75-90:10，甲醇与乙腈的混合溶剂的水溶液中甲醇与乙腈的混合溶剂与水的体积比＝25:75-90:10。进一步地，本专利技术提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的式(Ⅰ)二萜类化合物及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。更进一步，本专利技术提供式(Ⅰ)二萜类化合物或其药物组合物在制备治疗癌症药物中的用途；其中所述的癌症优选自肺癌、肠癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、淋巴癌或白血病。本专利技术提供了一个新的二萜类化合物、其制备方法及其用途，为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了物质基础，同时该二萜类具有抗肿瘤活性，临床可用于治疗各种肿瘤。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明但不限制本专利技术。实施例1：菌株Micromonosporasp.HM134的发酵培养(1)发酵菌种：发酵菌种为小单孢菌Micromonosporasp.HM134。(2)斜面培养：固体培养基(g/L)(组成：酵母抽提物4.0，麦芽抽提物10.0，葡萄糖4.0，CoCl2·6H2O0.005，琼脂18.0，蒸馏水配置，pH值7.0-7.2)于121℃下灭菌20min，接种后在28℃下培养6-8天。(3)种子培养：将种子培养基组成(g/L)(葡萄糖4.0，麦芽抽提物10.0，酵母抽提物4.0，CaCO32.0，蒸馏水配置，pH值7.2-7.4)于121℃下灭菌20min，用1000ml的三角瓶每瓶分装250ml，然后用无菌水将斜面上的小单孢菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1×107～1×108个/ml。每瓶加2ml孢子悬浮液，置于摇床上，转速250r/min，28℃培养48h，得种子液。(4)发酵：将发酵培养基组成(g/L)(可溶性淀粉60，葡萄糖20，黄豆饼粉15，酵母抽提物5，麦芽抽提物5，CaCO32，NaCl3，蒸馏水配置，pH值7.2-7.4，)于121℃下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二萜类化合物,其特征在于，其化学结构式如式(I)所示：

【技术特征摘要】
1.一种二萜类化合物,其特征在于，其化学结构式如式(I)所示：。2.一种制备如权利要求1所述的二萜类化合物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)在包含碳源和氮源的培养基中发酵培养小单孢菌(Micromonosporasp.HM134，其保藏编号为CGMCCNo.15401)，并收集发酵液；(2)将步骤(1)收集得到的发酵液，分离得到菌丝体和上清液，菌丝体经过有机溶剂A提取得到提取液；上清液经树脂吸附，然后用有机溶剂B洗脱得到洗脱液；合并提取液和洗脱液，得合并液；(3)将步骤(2)所得合并液，依次经过浓缩、萃取、浓缩、硅胶柱层析、凝胶柱层析后得到含有二萜类化合物的流分样品；(4)将步骤(3)中得到的流分样品进行反相柱层析得到二萜类化合物。3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(1)所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、工业糖蜜、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、麦芽糖、木聚糖或它们的组合，优选为可溶性淀粉与葡萄糖组合；所述的氮源选自酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、大豆粉、花生饼粉、棉籽饼粉、麦芽抽提物、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆干粉、麸皮、麸质粉、尿素、铵盐或它们的组合，优选为黄豆饼粉、酵母抽提物、麦芽抽提物或它们的组合。4.如权利要求2所述的方法，其中步骤(2)中所述树脂为大孔吸附树脂，优选为HP-20大孔吸附树脂，所述有机溶剂A选自低级酮、C1-C3醇或它们的混合物，优选自丙酮、甲醇、乙醇或者它们中的两种或多种的组合；所述有机溶剂B选自低级酮、C1-C3醇或它们的混合物，优选自丙酮、甲醇、乙醇或者它们中的两种或多种的组合。5.如权利要求2所述的方法，其中步骤(3)中所述的硅胶柱层析所使用的硅胶粒径选自100-200目，所述硅胶柱层析所使用的洗脱溶剂为C5-C8烷烃和脂肪酸酯的混合溶剂系统，所述硅胶柱层析所使用的洗脱方式优选为梯度洗脱；进一步地，所述C5-C8烷烃优选自正庚烷、正己烷或它们的混合物，所述脂肪酸酯优选为乙酸乙酯。6.如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：符格意，王继栋，张辉，王瑞俊，齐欢，吴敏，滕云，郑玲辉，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33