本发明专利技术提出了用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用。该探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列，2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。该探针可以同时或者分别对待测核酸样品中变异频率极低的突变EGFR S768I，EGFR L861Q，BRAF V600E进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。
【技术实现步骤摘要】
用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用，更具体地，本专利技术涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频DNA突变的方法以及检测低频DNA突变的方法。
技术介绍
肺癌有很高的发病率和死亡率，它的发病率在美国是第二位，在中国是第一位，死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者，很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90％的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究，科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。研究表明，肺癌患者的EGFR基因编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，85％-90％的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变，这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关，即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基的磷酸化，抑制EGFR下游信号转导。此外，一些在肺癌患者人群中低频出现的驱动突变，如EGFR基因20外显子上的S768I突变，21外显子上的L861Q突变，BRAF基因V600E突变，这些肺癌患者都能够从靶向药物的治疗中获益。对这些基因突变位点的检测能够使得肺癌患者有机会接受更好的治疗方案，从而提高其生活质量和存活机会。因而，关于这些低频出现的驱动突变的检测方法的发展迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术目的是至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。为此，本申请的专利技术人设计了一组DNA探针，这组DNA探针可以同时或者分别对肺癌患者外周血游离DNA(cfDNA/ctDNA)中的EGFRS768I，EGFRL861Q，BRAFV600E进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。同时，专利技术人还提出了富集低频DNA突变的方法，应用该方法通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，实现了无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的DNA，从而可进一步对肺癌患者靶向用药指导，以及在肺癌患者靶向治疗期间提供动态监控等。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种富集低频DNA突变的DNA探针。根据本专利技术的实施例，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列，2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。gccatcgtg(SEQIDNO:1)。aacagctgg(SEQIDNO:2)。gatttctctgta(SEQIDNO:3)。tacagagaaatc(SEQIDNO:4)。根据本专利技术的实施例，上述探针可以同时或者分别对待测核酸样品中变异频率极低的突变EGFRS768I，EGFRL861Q，BRAFV600E进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。根据本专利技术的实施例，上述探针还可以包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述探针具有LNA修饰。LNA可以与互补单链核苷酸杂交，亲和性比相应的寡核苷酸高得多，形成的杂交物的解链温度都很高。根据本专利技术实施例的探针具有更好的热稳定性和生物学活性。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及和第八位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸以及第八位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针5’端具有生物素标记。结合有生物素的探针可后续与链霉亲和素磁珠结合，进而进行磁珠纯化，进一步提高对低频DNA突变的富集的特异性。根据本专利技术的实施例，所述探针3’端具有磷酸修饰。探针的3’端进行磷酸修饰能阻止该探针在PCR过程中进行错误的延伸。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因20号外显子发生S7681突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因21号外显子发生L861Q突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，所述探针用于富集BRAF基因发生V600E突变的样本。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了前面所述的富集低频DNA突变的DNA探针在制备试剂盒中的用途，所述低频DNA突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断肺癌或指导用药。如前所述，前面所述的探针可以同时或者分别对待测核酸样本中低频DNA突变中的EGFRS768I，EGFRL861Q，BRAFV600E进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。进而利用上述探针制备获得的试剂盒能通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的DNA，进而判定肺癌患者是否有上述EGFR突变，进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。根据本专利技术的实施例，上述用途还可以包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述癌症相关突变为EGFR基因20号外显子发生S7681突变、EGFR基因21号外显子发生L861Q突变或BRAF基因发生V600E突变。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括前面所述的DNA探针。如前所述，前面所述的探针可以同时或者分别对待测核酸样本中低频DNA突变EGFRS768I，EGFRL861Q，BRAFV600E进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。进而包含上述探针的试剂盒能通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的DNA，进而判定肺癌患者是否有上述EGFR突变，进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种富集低频DNA突变的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1)对DNA片段进行第一PCR扩增处理，以便获得第一PCR扩增产物；2)对第一PCR扩增产物进行变性处理，以便获得变性产物；3)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～4所示的核苷酸序列，2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列，2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针具有LNA修饰；任选地，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第八位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸以及第八位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上；任选地，所述探针5’端具有生物素标记；任选地，所述探针3’端具有磷酸修饰。3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因20号外显子发生S7681突变的样本；任选地，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因21号外显子发生L861Q突变的样本；任选地，所述探针具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，所述探针用于富集BRAF基因发生V600E突变的样本。4.权利要求1～3任一项所述的富集低频DNA突变的DNA探针在制备试剂盒中的用途，所述低频DNA突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断肺癌或指导用药。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：林锐，濮悦，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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