The present invention relates to a connector for detecting low-frequency mutation. The connector comprises two complementary DNA single strands, one of which P5 strand is partially overlapped with upstream amplified primers, the other with upstream sequencing primers, the molecular tag of a specific nucleotide sequence combination, one prominent base T, and the other with P7 strand is sequentially wrapped from 5'to 3'. It consists of three parts: molecular tags that complement each other in reverse with molecular tags in the P5 chain; sequences that bind to downstream sequencing primers; and sequences that bind to downstream amplification primers. The invention also relates to a joint mixture for detecting low frequency variation and a corresponding method. The joint mixtures of the invention are used to prepare libraries and high throughput sequencing of samples containing low frequency variation and single chain damage, and combined with the bioinformatics analysis flow and algorithm disclosed by the invention, the accuracy of mutation detection is effectively improved.
【技术实现步骤摘要】
检测低频变异用的接头、接头混合物及相应方法
本专利技术涉及生物信息领域，尤其涉及基因检测，具体是指一种适用于检测低频体细胞变异和单链损伤变异的接头及其应用方法。
技术介绍
相比较一代测序技术，二代测序技术凭借着同时并行对数百万乃至上百亿条序列进行测序的优异性能，大幅降低了测序成本，迅速推动了其在科研、法医和临床等各领域的应用。例如，孕妇外周血浆中游离DNA中含有胎儿遗传信息，通过对孕妇的血浆游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)进行低深度全基因组测序，可以检测胎儿染色体异常，无创产前筛查迅速推动了基因检测行业的发展。而随着美国“精准医学计划”的提出，国内的肿瘤基因检测服务行业也在快速发展。近年来有研究表明凋亡或坏死的肿瘤细胞会将胞内的小片段DNA释放进入血液循环系统，这些DNA即是循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)。相较于通过手术、组织活检获取肿瘤标本的传统方式，ctDNA检测技术能很好地克服肿瘤时空异质性，重复检测方便，是目前液体活检技术的主流方向。但是相比较于胎儿DNA占孕妇血浆cfDNA中的比例(孕12周时可达4...
【技术保护点】
1.一种检测低频变异用的接头，其特征在于，所述的接头包括两条互补DNA单链，其中一条链P5链从5’端到3’端依次包括：与上游扩增引物部分重合的序列、与上游测序引物结合的序列、特定核苷酸序列组合的分子标签和1个突出碱基T；另一条链P7链从5’端到3’端依次包括三部分：与P5链中分子标签反向互补的分子标签、与下游测序引物结合的序列和与下游扩增引物结合的序列。
【技术特征摘要】
1.一种检测低频变异用的接头，其特征在于，所述的接头包括两条互补DNA单链，其中一条链P5链从5’端到3’端依次包括：与上游扩增引物部分重合的序列、与上游测序引物结合的序列、特定核苷酸序列组合的分子标签和1个突出碱基T；另一条链P7链从5’端到3’端依次包括三部分：与P5链中分子标签反向互补的分子标签、与下游测序引物结合的序列和与下游扩增引物结合的序列。2.根据权利要求1所述的检测低频变异用的接头，其特征在于，在P5链中，与上游扩增引物部分重合的序列、与上游测序引物结合的序列可以有部分序列重合，并且3’端硫代修饰；在P7链中，与下游测序引物结合的序列、与下游扩增引物结合的序列可以有部分序列重合甚至完全重合该链，并且5’端磷酸化修饰。3.根据权利要求1所述的检测低频变异用的接头，其特征在于，所述的上游扩增引物和下游扩增引物包括样本标签。4.根据权利要求1所述的检测低频变异用的接头，其特征在于，所述的接头为Y型截短型接头；所述的分子标签的长度为3～12bp。5.根据权利要求1所述的检测低频变异用的接头，其特征在于，P5链为如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，P7链为如SEQIDNO:4所示，所述的上游扩增引物为如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述的下游扩增引物为如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。6.一种接头混合物，其特征在于，所述的接头混合物包括按比例混合的至少八种权利要求1中所述的接头。7.根据权利要求6所述的接头混合物，其特征在于，所述的接头混合物中的双链分子标签组合的纵向同个位置上，四种碱基同时存在，优选地，从纵向上，分子标签组合中四种碱基A:T:G:C的比例接近1:1:1:1；从横向上，每个分子标签中避免出现连续4个及以上相同碱基的出现，优选地，在分子标签起始位置要避免连续2个及以上碱基G的出现。8.根据权利要求6所述的接头混合物，其特征在于，所述的接头混合物中各接头的双链分子标签互相之间至少有3个及3个以上核苷酸序列的差异；优选地，所述的接头混合物中各接头的双链分子标签的长度不能完全相同；优选地，所述的接头混合物中各接头按等比例混合，或者，根据测序数据中实际测得的比例再调整各接头混合的比例。9.一种用于检测低频体细胞变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别合成权利要求6至8中任一项所述的接头混合物中每对接头的P5链和P7链，退火形成Y型接头，并按比例混合形成接头混合物；(2)将带有双链分子标签的接头混合物与游离DNA片段样本进行连接反应，得到连接产物，并用带样本标签的上下游扩增引物对连接产物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)对扩增产物中的目的片段进行杂交捕获，得到靶向捕获文库，对靶向捕获文库进行高深度的双端测序，根据双端的样本标签对不同样本进行数据拆分；(4)对测序数据进行质控处理，去除低质量碱基、低质量读段和污...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳顶，章扬，任勇哲，王丹丹，戴珩，史耀舟，
申请(专利权)人：上海鲸舟基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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