半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法技术

本发明专利技术提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，该方法是在常规补料发酵工艺的基础上，通过多次循环进行部分放料和补充新鲜发酵培养基后继续发酵的工艺，将发酵液的OD600值控制在一定的范围内，使得在半连续发酵的循环期间，发酵液都处于吡咯喹啉醌高速合成期中，从而提高了生产效率。与传统的补料分批发酵工艺相比，本发明专利技术提高生产效率25～50％，降低主要发酵原料单耗12～20％，并且提高了生产连续性，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法
本专利技术属于发酵工程
，具体地说，涉及一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法。
技术介绍
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinine，PQQ)是一种水溶性的醌类化合物，最早在微生物中发现，在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅酶，随后的研究表明其也广泛存在于动植物体内，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，日本学者认为PQQ完全符合维生素的特征(Nature2003；422:832)，主张将其列为第14种维生素。目前的研究发现，PQQ具有调节体内自由基水平、刺激机体生长、促进神经生长因子合成、保护心脏、防治肝损伤、消炎、抑制某些肿瘤细胞、预防白内障、预防阿兹海默症、调节骨代谢平衡等多种生理功能。PQQ作为一种具有多种生理医学功效的生物活性物质，在抗衰老，以及炎症、溶血性贫血、传输神经兴奋失调症、肝病、骨质疏松症等疾病的治疗或辅助治疗方面具有很大的潜力，具有良好的医疗和保健开发前景。因为微生物发酵法生产PQQ具有巨大的成本优势，化学合成法生产PQQ的工艺已经被淘汰，能大量产生PQQ的微生物主要有甲基杆菌属(Methylobacteriumsp.)、甲基单胞菌属(Methylomonassp.)、食甲基菌属(Methylovorussp.)、黄色杆菌属(Xanthobactersp.)、生丝微菌属(Hyphomicrobiumsp.)等，而工业上已应用的生产PQQ的菌种主要是生丝微菌属(Hyphomicrobiumsp.)，所用到的发酵方法都是传统的补料分批发酵法。目前传统的PQQ分批发酵生产工艺具有两个突出的问题，一是每批发酵都要花大量时间培养增殖菌体，另一个是由于菌体和代谢产物的不断积累，PQQ高速合成期维持时间很短，限制了PQQ发酵产量的进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法。与一般的抗生素发酵不同，PQQ发酵有两大特点：其一，PQQ的发酵培养基配方是由低浓度的可溶性的无机盐和各种微量元素组成，配制好的PQQ新鲜发酵培养基无色透明，OD600值基本为零，因此在发酵中途向发酵罐中补充新鲜的发酵培养基，一方面能补充菌体生长和代谢需要的各种无机盐和微量元素，另一方面可以起到很好的稀释发酵液的作用。其二，PQQ发酵具有一些初级代谢的特征，整个发酵过程中，菌体生物量是一直增加的，而且在一定的范围内，PQQ的生物合成量(PQQ发酵单位增长速度)与菌体的生物量(发酵液OD600值)是正相关的。PQQ发酵的这两个特点使得半连续发酵工艺具有很好的应用基础。鉴于此，为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，以生丝微菌属(Hyphomicrobiumsp.)微生物作为发酵菌种，采用半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌；所述方法包括以下步骤：A、采用补料发酵的方法，待发酵液OD600＝35-60(优选OD600＝35-45)，进行部分放料和补充新鲜发酵培养基，将发酵液稀释至OD600＝25-30(优选OD600值为30左右)，继续发酵；B、待发酵液OD600＝35-60(优选OD600＝35-45)，按照步骤A的方法进行放料和补充新鲜发酵培养基，然后继续发酵；C、重复步骤B2-15次(优选8-10次)，结束发酵。前述的方法，步骤A中放料的体积为发酵液总体积的10-90％，优选25-30％。步骤A补料发酵的具体方法为：A1、制备种子液；A2、将步骤A1制备的种子液接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵全程用流加的方式补料甲醇，发酵液中甲醇浓度控制在0.1-1.0g/L。其中，步骤A1包括将活化后的斜面菌种接种至种子培养基内进行培养，培养温度为29-31℃，通气搅拌培养至OD600＝0.8-1.0，作为种子液。步骤A2中种子液的接种量为5-10％，发酵培养条件为：29-31℃，转速100-600rpm，通气量0.5-1.0vvm，DO≥30％；通过补氨水(浓度25-28％)控制发酵液的pH值为6.8-7.0。本专利技术中使用的种子培养基的配方为：(NH4)2SO42.4-3.6g/L，Na2HPO4·12H2O2.4-3.6g/L，KH2PO41.1-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.8-1.2g/L，CaCl2·2H2O17-25mg/L，ZnSO4·7H2O12-18mg/L，FeSO4·7H2O4.2-6.3mg/L，MnSO4·4H2O2.5-3.8mg/L，CuSO4·5H2O0.42-0.63mg/L，NaCl0.8-1.2mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O17-25μg/L，KI17-25μg/L，CoCl2·6H2O17-25μg/L，H3BO317-25μg/L，甲醇8-12ml/L，以水配制。优选地，种子培养基的配方为：(NH4)2SO43.0g/L，Na2HPO4·12H2O3.0g/L，KH2PO41.4g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl2·2H2O21mg/L，ZnSO4·7H2O15.75mg/L，FeSO4·7H2O5.25mg/L，MnSO4·4H2O3.15mg/L，CuSO4·5H2O0.525mg/L，NaCl1.05mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O21μg/L，KI21μg/L，CoCl2·6H2O21μg/L，H3BO321μg/L，甲醇10ml/L，以水配制。发酵培养基配方为：(NH4)2SO42.4-3.6g/L，Na2HPO4·12H2O2.4-3.6g/L，KH2PO41.1-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.8-1.2g/L，CaCl2·2H2O17-25mg/L，ZnSO4·7H2O12-18mg/L，FeSO4·7H2O4.2-6.3mg/L，MnSO4·4H2O2.5-3.8mg/L，CuSO4·5H2O0.42-0.63mg/L，NaCl0.8-1.2mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O17-25μg/L，KI17-25μg/L，CoCl2·6H2O17-25μg/L，H3BO317-25μg/L，以水配制。优选地，发酵培养基配方为：(NH4)2SO43.0g/L，Na2HPO4·12H2O3.0g/L，KH2PO41.4g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl2·2H2O21mg/L，ZnSO4·7H2O15.75mg/L，FeSO4·7H2O5.25mg/L，MnSO4·4H2O3.15mg/L，CuSO4·5H2O0.525mg/L，NaCl1.05mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O21μg/L，KI21μg/L，CoCl2·6H2O21μg/L，H3BO321μg/L，以水配制。本专利技术所用的发酵生产PQQ的菌种为生丝微菌(Hyphomicrobiumsp.)DSM1869，购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。PQQ的补料分批发酵有一个显著的特点，发酵单位的增长速度与发酵液OD600值在一定范围内是正相关的，发酵前期发酵液OD600值很低，基本上没有什么发酵单位增长，随着菌体的增殖，当OD600值达到20以上时，发酵单位的增长速度逐渐加快，当OD600值达到35～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，以生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)微生物作为发酵菌种，采用半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌；所述方法包括以下步骤：A、采用补料发酵的方法，待发酵液OD600＝35‑60，进行部分放料和补充新鲜发酵培养基，将发酵液稀释至OD600＝25‑30，继续发酵；B、待发酵液OD600＝35‑60，按照步骤A的方法进行放料和补充新鲜发酵培养基，然后继续发酵；C、重复步骤B 2‑15次，结束发酵。

【技术特征摘要】
1.半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，以生丝微菌属(Hyphomicrobiumsp.)微生物作为发酵菌种，采用半连续发酵工艺生产吡咯喹啉醌；所述方法包括以下步骤：A、采用补料发酵的方法，待发酵液OD600＝35-60，进行部分放料和补充新鲜发酵培养基，将发酵液稀释至OD600＝25-30，继续发酵；B、待发酵液OD600＝35-60，按照步骤A的方法进行放料和补充新鲜发酵培养基，然后继续发酵；C、重复步骤B2-15次，结束发酵。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A和B中，待发酵液OD600＝35-45，进行部分放料和补充新鲜发酵培养基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中放料的体积为发酵液总体积的10-90％，优选25-30％。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A补料发酵的具体方法为：A1、制备种子液；A2、将步骤A1制备的种子液接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵全程用流加的方式补料甲醇，发酵液中甲醇浓度控制在0.1-1.0g/L。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A1包括将活化后的斜面菌种接种至种子培养基内进行培养，培养温度为29-31℃，通气搅拌培养至OD600＝0.8-1.0，作为种子液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A1中所述种子培养基的配方为：(NH4)2SO42.4-3.6g/L，Na2HPO4·12H2O2.4-3.6g/L，KH2PO41.1-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.8-1.2g/L，CaCl2·2H2O17-25mg/L，ZnSO4·7H2O12-18mg/L，FeSO4·7H2O4.2-6.3mg/L，MnSO4·4H2O2.5-3.8mg/L，CuSO4·5H2O0.42-0.63mg/L，NaCl0.8-1.2mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O17-25μg/L，KI17-25μg/L，CoCl2·6H2O17-25μg/L，H3BO317-25μg/L，甲醇8-12ml/L，以水配制；优选地，种子培养基的配方为：(NH4)2SO43.0g/L，Na2HPO4·12H2O3.0g/L，KH2PO41.4g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵子刚，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11