一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：(1)将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中活化；(2)将活化后的菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养；(3)将得到的培养液继续接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养；(4)将培养液接入发酵培养基中，100‑700rpm，0.5‑5vvm培养144‑240h；发酵至0‑72h时，添加非离子型表面活性剂，并采用插入式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。本发明专利技术的优点在于：提供了简便、有效、经济的发酵工艺，有效提高维生素K2浓度，提高生产效率，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法
本专利技术涉及生物技术制备领域，尤其涉及一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法。
技术介绍
维生素K2(menaquinone，简写为MK)，是一种脂溶性维生素，是人体中不可缺少的重要维生素之一，能影响凝血酶原的合成和凝血，具有易于吸收、生物利用度高、生物活性强且对人体毒副作用小等诸多优点，目前临床用于治疗维生素K缺乏性出血症、防治骨质疏松和抗肿瘤等。目前，维生素K2的生产方法主要集中在化学合成和天然物提取，利用生物法生产维生素K2还处于起步阶段。微生物法制备维生素K2相比化学合成法的优势在于原料成本低、条件要求温和、环境污染少且产物具有较高生物活性。目前发酵领域中用于合成维生素K2的菌种包括革兰氏阴性菌黄杆菌(主产MK-4)及革兰氏阳性菌纳豆芽孢杆菌(主产MK-6)，但维生素K2产量均不理想。为了提高发酵效率，研究者从发酵菌种的改造和发酵工艺优化等方面进行了大量的研究工作，例如维生素K2代谢途径关键基因的改造，菌种的理化诱变，发酵培养基优化，发酵过程参数调控等等。利用超声波和表面活性剂提高微生物发酵过程中菌体细胞通透性是一种常见的细胞代谢人工调控方法。表面活性剂能改善细胞膜通透性，在微生物发酵中经常被用来提高目标产物的产量。在微生物发酵过程中加入表面活性剂，可加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高了菌体对底物、产物的耐受度，解决发酵产物、副产物对微生物细胞生长和催化活性的抑制。因此，在微生物发酵过程中添加表面活性剂对增加终产物浓度，提高生产效率，缩短反应周期，降低生产成本，具有重要的现实意义。表面活性剂种类繁多且性质各不相同，它们一方面具有改善细胞膜通透性，减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力，加快物质传递运输的能力；另一方面对微生物有毒性和杀菌作用。一般来说阳离子表面活性剂对细胞的毒性较大；非离子表面活性剂毒性小，对细胞的影响也较弱；阴离子表面活性剂的毒性和杀菌力介乎两者之间。超声波有很强的生物学效应，在发酵过程中可增加细胞膜的通透性和选择性,能够在细胞表面瞬间造成微伤，使细胞壁局部破裂，从而改善细胞膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质进入细胞内，低功率时，伤口很小，容易被自身修复，不会对生物体造成损伤或死亡。对于维生素K2发酵来说，如何保证氧和营养物质的传递吸收，促进维生素K2的胞外分泌能力，对进一步提高维生素K2产量具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种通过非离子表面活性剂和超声辐照协同作用来改善细胞膜通透性，从而进一步有效提高维生素K2产量的生产维生素K2的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：(1)菌株活化将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中进行活化；(2)一级种子制备将活化后的维生素K2生产菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-24h，制成一级种子备用；(3)二级种子制备按照接种量3％-10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-16h，制成二级种子备用；(4)发酵培养按装液量40％-70％，接种量1％-15％将二级种子培养液接入发酵培养基中，100-700rpm，0.5-5vvm培养144-240h；发酵至0-72h时，在培养基中添加非离子型表面活性剂，并采用插入式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。作为本专利技术的优选方式之一，所述非离子型表面活性剂具体为Span、Tween、Triton、OP和POE中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中非离子表面活性剂加入方式是一次性加入、分批加入或流加，浓度范围0.01-50g/L。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中插入式低功率超声间隔处理的超声功率为100-500W，频率为10-30KHz。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中插入式低功率超声间隔处理的处理时间为发酵24-96h后每隔12-24h超声30-400s。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中定时取样指每隔6-12h取样一次，直至发酵结束。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中通过分光光度计检测细胞浓度，通过液相色谱仪检测维生素K2浓度。作为本专利技术的优选方式之一，所述维生素K2生产菌株具体为黄杆菌和纳豆芽孢杆菌中的一种。作为本专利技术的优选方式之一，所述黄杆菌由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCCAB2010137；所述纳豆芽孢杆菌由中国典型培养物保藏管理中心提供，编号NKCCMRNK2.新natto。本专利技术原理：通过非离子表面活性剂和超声辐照协同作用，一方面降低培养基表面张力，减小菌体表面和培养基的界面阻力，减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力，促进营养物质传输，加速细胞的生长；另一方面促使微生物代谢产物易于分泌至胞外，利于消除产物、副产物抑制，特别是减少胞内维生素K2累积对细胞生长和细胞催化活性的抑制，从而有利于维生素K2的合成。本专利技术相比现有技术的优点在于：本专利技术提供了简便、有效、经济的发酵工艺，解决发酵终产物产量低以及发酵过程产物、副产物对细胞生长和细胞催化活性的抑制，有效提高发酵终产物浓度，提高生产效率，降低生产成本，易于实现工业化应用；其中，本专利技术的维生素K2最终浓度提高了183％-364％。附图说明图1是实施例1-8中通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法的流程图；图2是实施例2-4中未经表面活性剂和超声处理所得MK6的HPLC检测对照图；图3是实施例2中MK6的HPLC检测图；图4是实施例3中MK6的HPLC检测图；图5是实施例4中MK6的HPLC检测图；图6是实施5-7中未经表面活性剂和超声处理所得MK7的HPLC检测对照图；图7是实施例5中MK7的HPLC检测图；图8是实施例6中MK7的HPLC检测图；图9是实施例7中MK7的HPLC检测图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1如图1所示，本实施例的一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，包括如下步骤：(1)菌株活化以黄杆菌(由中国普通微生物菌种保藏中心提供，编号为CCTCCAB2010137)为出发菌，将黄杆菌接种于斜面培养基中活化，斜面培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，鱼粉蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂1.5％，pH7.4，培养温度为30℃，培养48h；(2)一级种子制备将活化后的黄杆菌菌株接种于添加有0.01g/LSpan的种子培养基中培养12h，制成一级种子备用；种子培养基成分为：甘油5g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物2.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，Span0.01g/L，pH7.2，培养温度37℃；(3)二级种子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌株活化将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中进行活化；(2)一级种子制备将活化后的维生素K2生产菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12‑24h，制成一级种子备用；(3)二级种子制备按照接种量3％‑10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12‑16h，制成二级种子备用；(4)发酵培养按装液量40％‑70％，接种量1％‑15％将二级种子培养液接入发酵培养基中，100‑700rpm，0.5‑5vvm培养144‑240h；发酵至0‑72h时，在培养基中添加非离子型表面活性剂，并采用插入式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。

【技术特征摘要】
1.一种通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌株活化将维生素K2生产菌株接种于斜面培养基中进行活化；(2)一级种子制备将活化后的维生素K2生产菌株接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-24h，制成一级种子备用；(3)二级种子制备按照接种量3％-10％将步骤(2)得到的一级种子培养液接种于添加有非离子型表面活性剂的种子培养基中培养12-16h，制成二级种子备用；(4)发酵培养按装液量40％-70％，接种量1％-15％将二级种子培养液接入发酵培养基中，100-700rpm，0.5-5vvm培养144-240h；发酵至0-72h时，在培养基中添加非离子型表面活性剂，并采用插入式低功率超声间隔处理，定时取样检测细胞和维生素K2浓度。2.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂具体为Span、Tween、Triton、OP和POE中的一种。3.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其特征在于，所述步骤(2)中非离子表面活性剂浓度范围0.01-8g/L。4.根据权利要求1所述的通过改善细胞膜通透性有效生产维生素K2的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，杨强，赵根海，刘会，王鹏，王丽，方雪，孙小雯，倪文枫，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34