一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定猪饲料蛋白质消化率的体外仿生消化方法，包括如下步骤：将饲料样品粉碎过标准筛；制备胃缓冲液及小肠缓冲液；制备模拟胃液、浓缩模拟小肠液、浓缩补充小肠液；将胃缓冲液、小肠缓冲液装入单胃动物仿生消化的保温室中，并连接好与模拟消化器相通的管道；将粉碎好的饲料样品装入模拟消化器中，加入模拟胃液后装入单胃动物仿生消化系统中；将上述胃、小肠各阶段仿生消化参数通过设置仿生消化系统的控制软件，自动完成猪饲料蛋白质的体外仿生消化过程；获得未消化残渣后，烘干后测定残渣及饲料样品的粗蛋白含量，计算蛋白质的消化率。本发明专利技术方法简单、精度高、实施成本低，可在48小时内准确地测定猪饲料的蛋白质消化率。

【技术实现步骤摘要】
一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法
本专利技术涉及一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法，尤指通过在实验室条件下全自动体外模拟猪的体内消化过程估测饲料蛋白质的消化率。
技术介绍
饲料的可消化蛋白及氨基酸等养分的含量是指导企业建立饲料原料蛋白质效价数据库与配方标准及招标采购、优化饲料配方的主要决策依据，也是我国实施从源头减少畜禽氮排泄量的重要技术支撑。目前，在配合饲料生产中，该数据均不是实测数据，而是查表或通过粗蛋白含量作经验校正，存在较大的偏差乃至误导，已经成为饲料工业隐性浪费之首。近半个世纪以来，人们在实测饲料蛋白质或氨基酸消化率的方法上仍以在猪回肠末端安装套管后通过代谢试验获得标准回肠末端(SID)可消化粗蛋白或氨基酸数据。该动物试验方法的测定周期约需要10～15天，耗时长、系统误差大、精度低、可重复性差等缺点无法满足现代畜牧业对精准、快速获取饲料可消化粗蛋白或氨基酸含量的基本要求。为了满足企业生产能在实验室条件下进行猪饲料蛋白质或氨基酸消化率的快速测定，欧美等发达国家一直致力于通过模拟猪饲料在胃-小肠的消化来建立一种快速评价饲料可消化蛋白质及氨基酸含量的技术。其中丹麦学者Boisen和Fernandez建立的胃蛋白酶——胰液素为体系的猪饲料蛋白质消化率的快速评定操作技术规程在国际上相对引用较多(见参考文献：Boisen,S.,andJ.A.Fernandez.Predictionoftheapparentilealdigestibilityofproteinandaminoacidinfeedstuffsandfeedmixturesforpigsbyinvitroanalyses.Anim.FeedSci.Technol.,1995,51:29-43)。然而，该方法存在以下缺陷：1)在胃、小肠模拟消化液的制备上，存在配制模拟消化液所用试剂——胰液素中的消化酶活性不清楚，导致配制成的模拟消化液活力也不清楚，引发消化能力难以重复；2)在模拟消化过程中，未阐明猪体内消化液的组成，在模拟目标物不清楚的前提下导致了胃、小肠消化阶段消化液中酶的活性与体内相差非常大；3)在猪的小肠模拟消化过程中，模拟小肠液都是在开始小肠消化时一次性加入，消化过程中消化酶活性是平稳还是衰减不清楚。由于猪胰液的分泌及消化道内消化酶活性均随采食呈周期性变化，因此，在体内虽然存在消化酶活性衰变的现象，但因有胰液的分泌而使消化酶的活性成脉冲式变化。在体外消化中如何模拟这一现象，仍鲜见报道；4)体外模拟消化过程都在以三角瓶为反应容器的密闭系统中进行，每一消化阶段pH值的改变、消化液的加入、产物的分离等都是通过手工操作实现；5)在水解产物的分离中，通过磺基水杨酸沉淀未消化蛋白，再过滤的方式分离水解物与未水解物，具有较大的人为随意性，往往导致未消化蛋白被过滤出去而视为已消化蛋白，从而引起测值大大高于体内测值。由于存在上述问题，该方法在诸多方面难以标准化，从而导致美国、加拿大等发达国家以及我国均未在饲料工业中采用该方法用于饲料原料蛋白质效价的测定。近年来，为了排除手工操作对体外模拟消化测试结果的干扰，结合现代自动化控制技术，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所于2009年研制了专用于猪禽的单胃动物仿生消化系统(参见专利号为ZL200910078147.1的中国专利技术专利“单胃动物仿生消化系统及基于该系统模拟单胃动物消化的方法”)。目前该专利技术已转让，并生产了标准化的单胃动物仿生消化仪器产品供行业使用(国内科研单位及饲料与养殖企业均有购置)。该仪器为猪体外消化技术的标准化及应用于饲料可消化蛋白与氨基酸含量的快速测定提供了技术基础。另一方面，随着蛋白质提纯技术的发展，专业公司(如Sigma公司，Amersco公司)已生产出高纯度的试剂级消化酶对外提供。以消化酶活性为参照，通过试剂级消化酶制备模拟消化液，可以实现体外消化中所用消化液消化活力的标准化。因此，在弄清猪体内消化过程基础参数的基础上，基于全自动体外模拟消化工具及高纯度试剂酶来实现模拟消化液的规范化及体外模拟消化过程的自动化；在弄清体外模拟消化过程中消化酶活性的衰变规律的基础上，通过补充消化酶后进一步提高体外对体内的模拟消化程度。基于上述技术改进，可以解决现有体外模拟消化方法的缺陷。综上，开辟新的方法进一步逼近对猪体内消化过程的模拟来快速测定饲料的可消化蛋白及氨基酸含量对解决行业的重大技术需求势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪饲料蛋白质或氨基酸消化率的体外快速测定方法。该方法通过体外全自动模拟猪胃、小肠两阶段的消化实现对猪饲料蛋白质或氨基酸回肠末端消化率的准确估测，解决了传统方法中模拟消化过程消化酶活性不清楚、消化酶活性衰减、消化过程手工操作及与体内法测定猪饲料回肠末端粗蛋白消化率相差10％以上的缺陷，同时，具有节耗、省资、重复性高、测试速度快的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种通过体外仿生消化测定猪饲料蛋白质消化率的方法，包括如下步骤：1)样品预处理：将猪饲料样品粉碎过标准筛，然后将粉碎后的样品经抽真空-充氮后低温储存备用；2)缓冲液的制备：以稀盐酸、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备胃缓冲液；以磷酸盐、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备小肠缓冲液；3)模拟胃液的制备：根据猪体内胃液中胃蛋白酶的活性，以试剂级胃蛋白酶制备模拟胃液；4)模拟小肠液的制备：根据猪体内空肠液中消化酶的活性，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩模拟小肠液；根据体外模拟消化中小肠阶段消化酶的衰变情况，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩补充模拟小肠液；5)上样：采用单胃动物仿生消化系统，其包括模拟消化器、消化液试剂瓶、缓冲液试剂瓶、废液收容瓶、清洗液储存瓶、清洗液试剂瓶和清洗残留液收容瓶，所述模拟消化器包括玻璃管和透析管，该玻璃管为一中空管体，该管体的两端各设有一磨口，该管体的侧面设有输入管和输出管，该透析管放置在该玻璃管内，该透析管的两端分别从该玻璃管的两个磨口处伸出而外翻，外翻露于磨口外侧的透析管端部被橡皮条捆扎固定在磨口上，捆扎透析管端部后的两个磨口分别塞有一硅胶塞和一带有输液管的硅胶塞；将步骤4)得到的浓缩模拟小肠液、补充浓缩模拟小肠液放入所述单胃动物仿生消化系统的消化液试剂瓶中；将步骤2)中得到的胃缓冲液、小肠缓冲液放入所述单胃动物仿生消化系统的缓冲液控温室；在所述单胃动物仿生消化系统预运行30～60分钟且各温度参数达到39℃后，将步骤1)制备的饲料样品倒入所述单胃动物仿生消化系统的模拟消化器的透析管内，并向所述透析管内加入步骤3)得到的模拟胃液，塞上胶塞；6)胃模拟消化：将所述胃缓冲液泵入到所述模拟消化器的透析管外再回到胃缓冲液试剂瓶中往复循环，通过回旋震荡提供模拟胃液与饲料样品的混合动力，进行胃的模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的胃缓冲液，泵入去离子水清洗胃模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；上述过程反复清洗多次，以便清洗干净；7)小肠模拟消化：将所述小肠缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到小肠缓冲液试剂瓶中一直往复循环，通过回旋震荡提供浓缩模拟小肠液与饲料样品的混合动力，在透析管中溶液的pH值本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过体外仿生消化测定猪饲料蛋白质消化率的方法，包括如下步骤：1)样品预处理：将猪饲料样品粉碎过标准筛，然后将粉碎后的样品经抽真空‑充氮后低温储存备用；2)缓冲液的制备：以稀盐酸、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备胃缓冲液；以磷酸盐、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备小肠缓冲液；3)模拟胃液的制备：根据猪体内胃液中胃蛋白酶的活性，以试剂级胃蛋白酶制备模拟胃液；4)模拟小肠液的制备：根据猪体内空肠液中消化酶的活性，以试剂级α‑淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩模拟小肠液；以试剂级α‑淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩补充模拟小肠液；5)上样：采用单胃动物仿生消化系统，其包括模拟消化器、消化液试剂瓶、缓冲液试剂瓶、废液收容瓶、清洗液储存瓶、清洗液试剂瓶和清洗残留液收容瓶，所述模拟消化器包括玻璃管和透析管，该玻璃管为一中空管体，该管体的两端各设有一磨口，该管体的侧面设有输入管和输出管，该透析管放置在该玻璃管内，该透析管的两端分别从该玻璃管的两个磨口处伸出而外翻，外翻露于磨口外侧的透析管端部被橡皮条捆扎固定在磨口上，捆扎透析管端部后的两个磨口分别塞有一硅胶塞和一带有输液管的硅胶塞；将步骤4)得到的浓缩模拟小肠液、补充浓缩模拟小肠液放入所述单胃动物仿生消化系统的消化液试剂瓶中；将步骤2)中得到的胃缓冲液、小肠缓冲液放入所述单胃动物仿生消化系统的缓冲液控温室；在所述单胃动物仿生消化系统预运行30～60分钟且各温度参数达到39℃后，将步骤1)制备的饲料样品倒入所述单胃动物仿生消化系统的模拟消化器的透析管内，并向所述透析管内加入步骤3)得到的模拟胃液，塞上胶塞；6)胃模拟消化：将所述胃缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到胃缓冲液试剂瓶中往复循环，通过回旋震荡提供模拟胃液与饲料样品的混合动力，进行胃的模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的胃缓冲液，泵入去离子水清洗胃模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；7)小肠模拟消化：将所述小肠缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到小肠缓冲液试剂瓶中一直往复循环，通过回旋震荡提供浓缩模拟小肠液与饲料样品的混合动力，在所述透析管中溶液的pH值变为小肠缓冲液的pH值后，往所述透析管内注入浓缩模拟小肠液，开始小肠的模拟消化；在消化4h后再次往透析管内注入浓缩补充模拟小肠液，继续小肠模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的缓冲液；8)水解产物的清洗：往所述单胃动物模拟消化器的透析管外泵入去离子水清洗整个模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；9)未消化残渣的分析及消化率的计算：将步骤9)透析管内的残渣转移到培养皿中并干燥，然后分别测定残渣及所述猪饲料样品的粗蛋白或氨基酸含量，计算粗蛋白或氨基酸的消化率。...

【技术特征摘要】
1.一种通过体外仿生消化测定猪饲料蛋白质消化率的方法，包括如下步骤：1)样品预处理：将猪饲料样品粉碎过标准筛，然后将粉碎后的样品经抽真空-充氮后低温储存备用；2)缓冲液的制备：以稀盐酸、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备胃缓冲液；以磷酸盐、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备小肠缓冲液；3)模拟胃液的制备：根据猪体内胃液中胃蛋白酶的活性，以试剂级胃蛋白酶制备模拟胃液；4)模拟小肠液的制备：根据猪体内空肠液中消化酶的活性，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩模拟小肠液；以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩补充模拟小肠液；5)上样：采用单胃动物仿生消化系统，其包括模拟消化器、消化液试剂瓶、缓冲液试剂瓶、废液收容瓶、清洗液储存瓶、清洗液试剂瓶和清洗残留液收容瓶，所述模拟消化器包括玻璃管和透析管，该玻璃管为一中空管体，该管体的两端各设有一磨口，该管体的侧面设有输入管和输出管，该透析管放置在该玻璃管内，该透析管的两端分别从该玻璃管的两个磨口处伸出而外翻，外翻露于磨口外侧的透析管端部被橡皮条捆扎固定在磨口上，捆扎透析管端部后的两个磨口分别塞有一硅胶塞和一带有输液管的硅胶塞；将步骤4)得到的浓缩模拟小肠液、补充浓缩模拟小肠液放入所述单胃动物仿生消化系统的消化液试剂瓶中；将步骤2)中得到的胃缓冲液、小肠缓冲液放入所述单胃动物仿生消化系统的缓冲液控温室；在所述单胃动物仿生消化系统预运行30～60分钟且各温度参数达到39℃后，将步骤1)制备的饲料样品倒入所述单胃动物仿生消化系统的模拟消化器的透析管内，并向所述透析管内加入步骤3)得到的模拟胃液，塞上胶塞；6)胃模拟消化：将所述胃缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到胃缓冲液试剂瓶中往复循环，通过回旋震荡提供模拟胃液与饲料样品的混合动力，进行胃的模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的胃缓冲液，泵入去离子水清洗胃模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；7)小肠模拟消化：将所述小肠缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到小肠缓冲液试剂瓶中一直往复循环，通过回旋震荡提供浓缩模拟小肠液与饲料样品的混合动力，在所述透析管中溶液的pH值变为小肠缓冲液的pH值后，往所述透析管内注入浓缩模拟小肠液，开始小肠的模拟消化；在消化4h后再次往透析管内注入浓缩补充模拟小肠液，继续小肠模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的缓冲液；8)水解产物的清洗：往所述单胃动物模拟消化器的透析管外泵入去离子水清洗整个模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；9)未消化残渣的分析及消化率的计算：将步骤9)透析管内的残渣转移到培养皿中并干燥，然后分别测定残渣及所述猪饲料样品的粗蛋白或氨基酸含量，计算粗蛋白或氨基酸的消化率。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述猪饲料为单一饲料原料或配合饲料；所述粉碎在万能粉碎机中进行；当生产中饲料原料粉碎过2mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为20～30s，过40目分级筛；当生产中饲料原料粉碎过1mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为60～90s，过60目分级筛；在所述步骤1)中，将粉碎后的样品经抽真空-充氮处理的方法具体如下：将粉碎后的样品先装入透气棉纸袋中，封口后再套入塑料样品袋内，接着在真空包装机上调节抽气时间为10～20s，充气时间为2～4s，加热封口时间为1....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵峰，王亚，张虎，高庆涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11