一种检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒。该试剂盒包括：预包被抗HB‑EGF蛋白单克隆抗体的96孔酶标板、辣根过氧化物酶（HRP）标记的HB‑EGF蛋白兔多克隆抗体、稀释液、洗涤液、显色液、终止液和HB‑EGF蛋白标准品。本发明专利技术制备的双抗体夹心法检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定量准确、简单易用、重现性好等特点，可检测细胞、血清、血浆和动物组织样品中HB‑EGF含量，可供基础研究和临床诊断中HB‑EGF蛋白的定性及定量检测，并可同时快速检测大批量样本，应用前景十分广阔。

An ELISA kit for detecting heparin-binding epidermal growth factor

The invention belongs to the field of immunoassay technology, in particular to an ELISA kit for detecting heparin-binding epidermal growth factor. The kit consists of 96-well enzyme plate pre-coated with monoclonal antibodies against HB EGF protein, rabbit polyclonal antibodies against HB EGF protein labeled with horseradish peroxidase (HRP), diluent, detergent, chromogenic solution, termination solution and standard HB EGF protein. The double antibody sandwich detection kit prepared by the invention has the characteristics of high sensitivity, strong specificity, accurate quantification, simple use and good reproducibility. It can detect the content of HB EGF in cell, serum, plasma and animal tissue samples. It can be used for qualitative and quantitative detection of HB EGF protein in basic research and clinical diagnosis, and can simultaneously rapidly detect a large number of samples. The application prospect is ten. It's broad.

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒。
技术介绍
肝素结合表皮生长因子(Heparin-bindingEpidermalGrowthFactor,HB-EGF)，即HB-EGF蛋白。近年来，大量研究结果提示，HB-EGF或可成为一个新的肿瘤标志物，有研究表明，部分乳腺癌和前列腺癌患者的HB-EGF表达水平与溶血磷脂酸-1(LPA-1，一种促肿瘤生长转移因子)的水平呈正相关，提示人们HB-EGF或可作为乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌等多种癌症的诊断及临床监测的分子标志物。HB-EGF作为多种肿瘤发生发展的重要的生物标志物，对其准确、快速的检测对肿瘤早期诊断、肿瘤发生发展机理的研究、发展分期的跟踪及临床治疗和预后情况判断的意义十分关键，故急需建立一种简便、高效、可用于对各类常见样本如细胞悬液、血清、血浆等的高通量快速检测的试剂和方法。目前国内市售HB-EGF蛋白ELISA试剂盒存在特异性差，产量低等缺点，因此亟需开发高特异性、高亲和性的HB-EGF抗体及相关试剂盒的研制，支持国内HB-EGF蛋白的各项基础研究，并进一步研制临床体外诊断试剂盒提供关键材料，加速产品的开发，填补该
的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低成本、检测灵敏度高、检测结果稳定、重复性好的肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的双抗体夹心法ELISA试剂盒。本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒，所述试剂盒采用的是双抗体夹心法，所述试剂盒包括特异性的HB-EGF蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体。所述单克隆抗体包括轻链可变区，其序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；还包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。其中，所述的特异性的HB-EGF蛋白单克隆抗体用于包被；所述辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体用于HB-EGF蛋白检测。其中所述HB-EGF单克隆抗体为鼠单克隆抗体；HRP标记的多克隆抗体为兔多克隆抗体。所述用于检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、底物显色液、反应终止液及HB-EGF蛋白的标准品；所述样品稀释液为含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)；所述洗涤液为含有0.1％吐温-20(Tween-20)的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；所述底物显示液由显色液A和显色液B组成，显色液A为过氧化氢，显色液B为四甲基联苯胺，显色液使用时取等体积的A、B液混匀；所述终止液为2mol/L的硫酸，所述HB-EGF蛋白标准品为重组HB-EGF蛋白。所述鼠单克隆抗体由重组HB-EGF蛋白免疫BALB/c鼠后，利用杂交瘤技术制备获得；所述HRP标记的兔多克隆抗体由重组HB-EGF蛋白免疫新西兰白兔，通过硫酸铵法纯化技术获得；按常规方法利用辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)标记抗体获得HRP标记的兔多克隆抗体，用于HB-EGF蛋白检测。本专利技术优选高特异性、高灵敏度的抗HB-EGF的单克隆抗体和多克隆抗体进行配对组合，将鼠单克隆抗体包被在固相载体上，它可特异性地结合重组HB-EGF蛋白及样本中的HB-EGF蛋白，当加入HRP标记的兔多克隆抗体，即形成固相抗体-抗原-酶标检测抗体复合物，应用显色剂对相应底物显色后终止，于450nm波长下读取各样本吸光度值，与标准曲线比较即可得出样品中HB-EGF蛋白的含量。本专利技术的有益效果：本专利技术采用双抗体夹心法定量检测样本中的HB-EGF蛋白含量，检测方法简便易行、检测灵敏度和准确度高、特异性强、重复性好、并能够同时快速检测大批量样本。本专利技术选择HB-EGF蛋白为标准品，HB-EGF含有一个21个氨基酸残基的肝素结合区，因而与肝素及其类似物硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan，HSPG)有较强的亲和力。固相酶联免疫法(ELISA法)具备技术成熟、灵敏度高、特异性好、操作简单、检测成本低、适用于大批量样本检测等优势。本专利技术的试剂盒中包被抗体为鼠单抗，只有一个抗原表位，特异性很好；检测抗体为兔多抗，偶联HRP后进行检测。试剂盒的主要组成部分的包被和检测抗体均为自主研发产品，因此相对于进口国外产品大大降低了成本，将在HB-EGF的相关基础和临床研究中发挥重要作用，具有广阔的市场前景。附图说明图1为96孔酶标板中各样品及对照组的加样示意图。图2为HB-EGF蛋白酶联免疫双抗体夹心法试剂盒的检测标准曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步解释本专利技术，但并不限制本专利技术的保护范围。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料。实施例1：HB-EGF酶联免疫试剂盒的组分制备(1)重组HB-EGF蛋白标准品的制备：所述试剂中的标准品为重组HB-EGF蛋白，用pET-30a-HB-EGF(Invitrogen公司)质粒转化入大肠杆菌诱导该蛋白在体外进行表达，再通过镍柱亲和层析法获得高纯度的HB-EGF蛋白。(2)抗HB-EGF鼠单克隆抗体的制备:a.动物免疫：采用雌性BALB/c纯系小鼠(购自南京大学动物模式研究所)作为免疫动物，以上述重组HB-EGF蛋白为免疫原进行免疫，免疫剂量为每只小鼠每次免疫100μg的重组HB-EGF。首次免疫时，将免疫原与等体积的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔3周后，取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，进行第二次加强免疫，二次免疫后尾静脉采血，使用间接ELISA法测定血清效价，血清效价达到1：105以上后，选择两只效价最高的小鼠进行第三次加强免疫(方法同第二次加强免疫)，间隔3周后，进行最后一次冲击免疫，冲击免疫为取200μgHB-EGF蛋白，添加PBS稀释到200μL，腹腔注射，完成冲击免疫3～4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。其中，所述的间接ELISA法具体方法如下：取出重组HB-EGF蛋白，用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将HB-EGF蛋白稀释为1μg/mL加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T洗涤3次后，拍干酶标板，第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000g离心15min分离血清，用样本稀释液(含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL的1:5000稀释HRP标记的山羊抗小鼠二抗(购自JacksonImmunoResearch公司)，37℃孵育30min。取出酶标板，经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100μL加入底物显示液，37℃避光显色10～15min，随后加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：105以上小鼠，进行第三次免疫。b.细胞融合与克隆化取免疫完成的小鼠脾脏，经80目网筛研磨过滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括特异性的HB‑EGF蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体轻链可变区如SEQ . ID.NO. 2所示，重链可变区如SEQ .ID.NO. 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肝素结合性表皮生长因子的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括特异性的HB-EGF蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体轻链可变区如SEQ.ID.NO.2所示，重链可变区如SEQ.ID.NO.1所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多克隆抗体，所述多克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HB-EGF单克隆抗体为鼠单克隆抗体。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体为兔多克隆抗体。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、底物显色液、反应终止液和HB-EGF蛋白的标准品。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晗青，屠志刚，
申请(专利权)人：江苏莱森生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32