一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种心肌肌钙蛋白I荧光和比色检测试剂盒及检测方法，属于免疫分析领域。该试剂盒包括心肌肌钙蛋白I、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、间羟基苯磷酸二钠盐、多巴胺。该试剂盒是通过在孔酶标板上依次吸附cTnI捕获抗体、cTnI和检测一抗形成类似三明治的结构，加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与检测一抗结合，最后加入底物间羟基苯磷酸二钠盐，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下生成间苯二酚，与多巴胺发生反应生成具有强紫外吸收和荧光发射的基团，进而实现对cTnI的定量检测。该试剂盒的检测结果与商品化的cTnI ELISA试剂盒的检测结果相符，可通过荧光激活和显色反应灵敏检测cTnI。

A fluorescence and colorimetric dual-signal detection kit for cardiac troponin I and its detection method

The invention provides a cardiac troponin I fluorescence and colorimetric detection kit and a detection method, belonging to the field of immunoassay. The kit includes cardiac troponin I, cTnI capture antibody, cTnI detection of primary antibody, alkaline phosphatase labeled secondary antibody, m-hydroxybenzene phosphate disodium salt and dopamine. The kit is a sandwich-like structure formed by successively adsorbing cTnI capture antibody, cTnI and detecting primary antibody on the porous enzyme label plate. The secondary antibody labeled with alkaline phosphatase is specifically combined with the primary antibody. Finally, the substrates of m-hydroxybenzene phosphate disodium salt are added to produce resorcinol under the action of dephosphorylation of alkaline phosphatase, which reacts with dopamine to produce strong violet. External absorption and fluorescence emission groups were used to quantitatively detect cTnI. The results of this kit are consistent with those of commercial cTnI ELISA kit. It can be sensitively detected by fluorescence activation and color reaction.

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于免疫分析领域，具体涉及一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
酶联免疫吸附分析(ELISA)基于抗原抗体特异性识别作用，并以酶作为信号输出单元而实现抗原高灵敏检测的技术，是生物样品分析中的一个重要的免疫方法。酶广泛地作为免疫分析中的标记物，基于酶高效的生物催化活性，一个酶分子可以在短时间内将大量的酶底物转化成产物，从而发挥信号放大的作用，这为分析物的灵敏检测奠定基础。碱性磷酸酶(ALP)是一种磷酸水解酶，该酶广泛分布于人体组织和体液。在碱性环境中，ALP能水解磷酸单酯化合物，切断底物分子中的磷酸酯键，从而脱掉底物中的磷酸基团。该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，包括骨病，糖尿病，乳腺癌和前列腺癌和肝炎。此外，ALP由于其较高的催化活性、较好的稳定性、易于和抗体偶联等特点，也经常作为ELISA的信号输出酶。生物标志物可客观测定和评价普通生理、病理或治疗过程中的某种特征性，指示不同的疾病导致的致病过程，生物标志物的监测是基础和临床研究中的重要手段。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到重要作用。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌梗死患者血清中的一个重要标志物，正常成年人血清中cTnI浓度通常低于0.2ng/mL，而心肌梗死爆发后，患者血清中cTnI含量在3-6小时内上升至50ng/mL，最后升至550ng/mL左右。因此，cTnI的准确定量对心肌梗死疾病的诊断和监控具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种心肌肌钙蛋白I荧光和比色双信号检测试剂盒及检测方法，该检测方法准确方便，具有普适性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术首先提供一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，包括：心肌肌钙蛋白I(cTnI)、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)、多巴胺、封闭液、二乙醇胺(DEA)缓冲液和MgCl2溶液。在上述技术方案中，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。在上述技术方案中，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。在上述技术方案中，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.01～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液。在上述技术方案中，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。在上述技术方案中，所述的间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)的浓度为50～500μM，多巴胺的浓度为20～200μM。在上述技术方案中，所述的DEA缓冲液是浓度为10～200mM、pH9.5～12.0的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～5mM。本专利技术还提供一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，包括以下步骤：步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内液体并用洗涤液清洗，再向孔内加入封闭液，孵育后弃去孔内液体，再用洗涤液清洗，之后加入用样品稀释液稀释的不同浓度的的cTnI标准溶液并进行孵育，接着弃去孔内液体后用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗接着进行孵育后，弃去孔内液体后并用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗；步骤二：在孔内加入m-HPP溶液，MgCl2溶液，DEA缓冲溶液，孵育后再加入多巴胺溶液，孵育后进行荧光和紫外光谱测试。在上述技术方案中，所述心肌肌钙蛋白I的检测方法具体包括以下步骤：步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释200倍，取100μL加入酶标板后在4℃孵育过夜或者室温孵育2.5h，弃去孔内液体并用300μL洗涤液洗3次，在孔内加入200μL封闭液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗3次，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的cTnI标准溶液并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液洗3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的cTnI检测一抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次；步骤二：在孔内加入30μL1mMm-HPP溶液，30μLMgCl2溶液，150μLDEA缓冲溶液，37℃孵育60min后再加入30μL0.5mM多巴胺溶液，37℃孵育20min后进行荧光(激发波长415nm)和紫外光谱测试。在上述技术方案中，步骤一中的cTnI捕获抗体的浓度为1～50μg/mL，cTnI检测一抗的浓度为0.5～20μg/mL，碱性磷酸酶标记的二抗的浓度为0.01～1μg/mL。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，该试剂盒是基于碱性磷酸酶引发的原位荧光和显色反应检测心肌梗死标志物cTnI，其原理是基于抗原抗体特异性作用和酶的信号放大效应，通过在酶标板上依次吸附捕获抗体、cTnI和cTnI检测一抗来形成类似三明治的结构，后续加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与cTnI检测一抗结合，最后加入底物m-HPP，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下，m-HPP被脱磷酸化生成间苯二酚阴离子，与后续加入的多巴胺发生反应生成具有强紫外吸收和荧光发射的基团，体系的吸光度和荧光强度与碱性磷酸酶的浓度成正相关，而cTnI浓度与碱性磷酸酶浓度正相关，进而实现对cTnI的定量检测。碱性磷酸酶作为连接cTnI浓度和光谱信号的桥梁，利用碱性磷酸酶引发的反应作为输出信号，将该试剂盒用于血清基质中cTnI含量的检测，结果表明该试剂盒的检测结果正好与基于pNPP的比色ELISA方法相符，该试剂盒可通过荧光激活和显色反应而检测cTnI。同时，该方法具有普适性，只需根据不同的靶标抗原更换相应的捕获抗体和检测一抗，就可将其应用拓展到其他癌症标志物的检测。本专利技术提供的cTnI检测方法，该方法是以碱性磷酸酶作为ELISA信号输出酶来提供一种荧光的信号输出模式，碱性磷酸酶具有的脱磷酸作用将m-HPP转变成间苯二酚，然后加入多巴胺溶液，间苯二酚和多巴胺能发生反应产生具有强吸收和荧光发射的基团，最终通过荧光和显色反应来检测肿瘤标志物cTnI。附图说明图1为本专利技术实施例1基于碱性磷酸酶引发的原位荧光和显色反应检测心肌梗死标志物cTnI的酶联免疫方法示意图。图2为本专利技术实施例1-2中的ELISA的荧光强度和紫外吸收强度和cTnI浓度的曲线关系图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做以详细说明。本专利技术提供一种心肌肌钙蛋白I荧光检测试剂盒，包括：心肌肌钙蛋白I(cTnI)、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)、多巴胺、封闭液、碳酸钠溶液、二乙醇胺(DEA)缓冲液和MgCl2溶液。本专利技术所述的cTnI捕获抗体、cTnI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，包括：心肌肌钙蛋白I、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐、多巴胺、封闭液、二乙醇胺缓冲液和MgCl2溶液。

【技术特征摘要】
1.一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，包括：心肌肌钙蛋白I、cTnI捕获抗体、cTnI检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、包被缓冲液、洗涤液、抗体稀释液、样品稀释液、间羟基苯磷酸二钠盐、多巴胺、封闭液、二乙醇胺缓冲液和MgCl2溶液。2.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。3.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.01～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。4.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.01～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。6.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的间羟基苯磷酸二钠盐(m-HPP)的浓度为50～500μM，多巴胺的浓度为20～200μM。7.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的荧光和比色双信号检测试剂盒，其特征在于，所述的DEA缓冲液是浓度为10～200mM、pH9.5～12.0的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～5mM。8.如权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将cTnI捕获抗体用包被缓冲液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀荣，赵佳会，孙健，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22