一种制备P2X7R免疫原的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备P2X7R免疫原的方法，对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白并进行检测。本发明专利技术的有益效果是能够获得免疫原性P2X7R胞外段，用于P2X7R抗体制备。

A Method for Preparing P2X7R Immunogen

The invention discloses a method for preparing P2X7R immunogen, optimizing the amino acid sequence of the extracellular segment of P2X7R protein, using full gene synthesis, inserting the coding sequence of the extracellular segment of P2X7R gene into the expression vector pET30a through restriction enzyme digestion sites NdeI and HindIII, and confirming the accuracy of the final expression vector by enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid encoding sequence protein was transformed into BL21 expression strain and induced by IPTG. The P2X7R protein was purified by affinity chromatography and detected. The beneficial effect of the present invention is that the immunogenic extracellular segment of P2X7R can be obtained and used for the preparation of P2X7R antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种制备P2X7R免疫原的方法
本专利技术属于制药
，涉及人类嘌呤能离子通道型受体7(purinergicligand-gatedionchannel7receptor,P2X7R)的胞外段免疫原制备、纯化及鉴定。
技术介绍
在细胞损伤、缺氧或炎症状态时，体内多种细胞释放大量ATP，进入细胞外间隙的ATP及其分解产物ADP和AMP作用于P2受体。P2受体包括离子通道型P2X受体(P2X1～7)和代谢型G-蛋白偶联P2Y受体(P2Y1/2/4/6/11/12/13/14)，其中ATP/P2X7R信号通路参与诱导炎性细胞因子分泌，与炎症发生发展密切相关。T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等多种免疫细胞上均可检测到P2X7R的表达。不同细胞利用ATP/P2X7受体通路发挥不同的功能。在多种自身免疫性疾病的研究中已证实ATP/P2X7受体信号通路对病程、病情的调控作用。P2X7R亚基的胞外环上有ATP结合位点，胞内含有一个短链N端和一个长链C端，C端为P2X7R受体的主要功能结构域。N端的结构序列高度保守，由395个氨基酸残基组成，与P2X7R受体家族其它亚型有35％-40％的同源性；C端由200个氨基酸残基组成，是P2X受体家族成员中最长的，与P2X受体家族其它亚型无同源性。研究证实应用小鼠的P2X7R抗体阻断P2X7R的体内信号传导，可减轻ATP诱导的炎症反应。因此P2X7R抗体成为治疗炎症及自身免疫性疾病的新靶标，而且可以从源头减少促炎因子的释放，因而靶向P2X7R的药物可能较靶向其它参与炎症或免疫性疾病的促炎因子等具有更广阔治疗效果和应用范围。目前主要使用P2X7R拮抗剂研究及治疗相关炎症及自身免疫性疾病，如临床使用P2X7R拮抗剂AZD9056及EC-224.535治疗自生免疫性疾病类风湿性关节炎，但效果不明显。因此本领域急切需要靶向且高效的治疗患者的抗P2X7R抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备P2X7R免疫原的方法，本专利技术的有益效果是能够获得免疫原性P2X7R胞外段，用于P2X7R抗体制备。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰；步骤3：(1)上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白；全菌采用20mMPB，300mMNaCl，20mMImidazole含1％TritonX-100，1mMDTT，1mMPMSF超声裂解，同时以20mMPB，300mMNaCl，20mMImidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测；(2)包涵体通过亲和层析纯化P2X7R蛋白；包涵体采用20mMPB，300mMNaCl含1％TritonX-100，5mMDTT洗涤后，以20mMPB，300mMNaCl，8MUrea，20mMImidazole，1mMDTT缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。附图说明图1为图1SDS-PAGE分析P2X7R蛋白于BL21(DE3)表达情况；图2为SDS-PAGE分析P2X7R蛋白上清纯化结果；图3为SDS-PAGE分析包涵体中P2X7R蛋白纯化结果；图4为P2X7R蛋白质检结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。一种制备P2X7R免疫原的方法，按照以下步骤进行：步骤1：P2X7R胞外区域的克隆；使用密码子优化软件对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性。为了便于纯化，在重组蛋白的N端添加了His-tag。步骤2：表达；将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中并进行IPTG诱导表达。将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图1，其中LaneM:SDS-PAGEProteinMarker；Lane0:对照；Lane1:15℃诱导16h；Lane2:37℃诱导16h。步骤3：纯化；(1)上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白全菌采用20mMPB(pH7.2)，300mMNaCl，20mMImidazole含1％TritonX-100，1mMDTT，1mMPMSF超声裂解，同时以20mMPB(pH7.2)，300mMNaCl，20mMImidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，分析结果见图2，LaneM:SDS-PAGEProteinMarker；Lane1:全菌破菌离心后上清；Lane2:上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane3:50mMImidazole的洗脱组分；Lane4-6:100mMImidazole的洗脱组分；Lane7-9:300mMImidazole的洗脱组分。(2)包涵体通过亲和层析纯化P2X7R蛋白包涵体采用20mMPB(pH7.2)，300mMNaCl含1％TritonX-100，5mMDTT洗涤后，以20mMPB(pH7.2)，300mMNaCl，8MUrea，20mMImidazole，1mMDTT缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图3。LaneM:SDS-PAGEProteinMarker；Lane1:包涵体溶解离心后上清；Lane2:上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane3-4:50mMImidazole的洗脱组分；Lane5-7:100mMImidazole的洗脱组分；Lane8-10:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备P2X7R免疫原的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5‑0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS‑PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰；步骤3：(1)上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白；全菌采用20mM PB，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X‑100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以20mM PB，300mM NaCl，20mM Imidazole缓冲液平衡Ni‑IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‑PAGE分析检测；(2)包涵体通过亲和层析纯化P2X7R蛋白；包涵体采用20mM PB，300mM NaCl含1％Triton X‑100，5mM DTT洗涤后，以20mM PB，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole，1mM DTT缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni‑IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‑PAGE分析检测。...

【技术特征摘要】
1.一种制备P2X7R免疫原的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵荣兰，彭效祥，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37