一种具有抗炎症性肠病活性的羧甲基茯苓多糖及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抗炎症性肠病活性的羧甲基茯苓多糖及其制备方法与应用，所述羧甲基茯苓多糖是利用DEAE‑52纤维素层析柱、Sephadex‑G200+G150层析柱联用，对羧甲基茯苓粗多糖（已申请专利CN 105348407 A）进行纯化，用0.1 mol/L NaCl溶液洗脱得到羧甲基茯苓多糖（CMP33）。该多糖的组成为D‑葡萄糖，分子量为15.23×10

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗炎症性肠病活性的羧甲基茯苓多糖及其制备与应用
本专利技术属于功能食品与生物制药领域，具体涉及一种具有抗炎症性肠病(IBD)活性的羧甲基茯苓多糖CMP33及其制备与应用。
技术介绍
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，收载于《中国药典》，位列中药“四君八珍”之中，别称玉灵、茯灵、松苓、茯菟等，具有很高的食补和药用价值，具有祛湿利尿、健脾和胃、安神宁心等功效，是一种药食两用的传统中药材。茯苓多糖为茯苓的主要有效成分，占茯苓菌核的80％以上。茯苓多糖经羧甲基化改性后可得到水溶性羧甲基茯苓多糖，具有抗肿瘤、抗炎、免疫增强等作用。目前，对于茯苓多糖羧甲基化改性、纯化以及评价其生物活性，并分析其构效关系等系统的研究工作仍处于起步阶段，尤其是对纯化羧甲基茯苓多糖的抗炎作用的研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术以羧甲基茯苓粗多糖为原料，利用离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱分离纯化出羧甲基茯苓多糖，并对纯化组分羧甲基茯苓多糖CMP33进行了结构鉴定，评价了体外抗氧化活性、体外抗肿瘤活性以及体外抗炎活性。建立了TNBS致小鼠急性结肠炎模型，使用纯化组分CMP33对受试小鼠进行灌胃治疗，评价了其体内抗炎活性。本专利技术的目的是提供一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(IBD)的活性羧甲基茯苓多糖及其制备方法，可应用于功能食品与生物制药领域。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。一种羧甲基茯苓多糖CMP33的制备方法，所述多糖是利用DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex-G200+Sephadex-G150层析柱联用，对现有的羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1mol/LNaCl溶液为洗脱液洗脱得到的羧甲基茯苓多糖CMP33。进一步地，所述现有羧甲基茯苓粗多糖由中国专利文献CN105348407A公开的羧甲基茯苓多糖的制备工艺制得。进一步地，所述多糖CMP33的单糖组成为D-葡萄糖，所述多糖分子量为15.23×104Da，结构为(1→3)-β-D-葡聚糖，含有(1→6)和(1→2)糖苷键，具有三螺旋结构。本专利技术还提供了所述制备方法制得一种羧甲基茯苓多糖CMP33。进一步地，所述CMP33对自由基DPPH、·ABTS+、·OH的EC50值分别为3.62mg/mL、3.55mg/mL、2.31mg/mL。所述多糖CMP33在31.25-1000μg/mL浓度范围内对结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901以及肺癌细胞A549细胞增殖有抑制作用，对应的IC50值分别为113.3μg/mL、282.7μg/mL、385.8μg/mL、79.56μg/mL、204.1μg/mL。所述多糖CMP33能显著抑制脂多糖LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)，在31.25-1000μg/mL浓度范围内，对LPS诱导的NO、IL-6、TNF-α及IL-1β生成的抑制率分别达到52.31％、47.96％、79.68％及51.80％，具有抗炎活性。所述多糖CMP33无LPS诱导时可激活RAW264.7细胞分泌NO、IL-6、TNF-α及IL-1β，具有免疫调节作用。所述多糖CMP33灌胃给药处理改善三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的炎症性肠病(IBD)小鼠的宏观表现，降低小鼠结肠病理切片组织学评分，降低小鼠结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)的含量。所述多糖CMP33在制备功能食品与生物制药中的应用，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(IBD)的活性。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术除使用DEAE-52纤维素层析柱之外，更重要的是使用了Sephadex-G200+Sephadex-G150两种层析柱联用，对羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1mol/LNaCl溶液为洗脱液得到羧甲基茯苓多糖CMP33。实验表明，羧甲基茯苓多糖CMP33是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗炎症性肠病(IBD)的活性多糖。附图说明图1为DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线(横坐标为管数，纵坐标为吸光度值)。图2为Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线(横坐标为管数，纵坐标为吸光度值)。图3为CMP33的HPGPC色谱图(横坐标为时间min，纵坐标为电压mv)。图4为CMP33红外光谱图(横坐标为波数，纵坐标为透过率)。图5A为混合标准品的GC图(横坐标为时间min，纵坐标为丰度)。图5B为CMP33的GC图。图6A为混合标准品的Smith降解产物GC图。图6B为CMP33的Smith降解产物GC图。图7A为CMP33的1H的NMR谱图(横坐标是化学位移)。图7B为13C的NMR谱图。图7C为HSQC的NMR谱图。图7D为H-HCOSY的NMR谱图。图7E为HMBC的NMR谱图。图8为不同碱浓度下CMP33与刚果红混合液的最大吸收波长变化折线图(横坐标为NaOH的浓度,纵坐标为最大吸收波长。图9A为不同浓度CMP33对RAW264.7细胞增殖的影响情况柱状图(横坐标为浓度，纵坐标为RAW264.7细胞的相对活度)。图9B为不同浓度LPS对RAW264.7细胞增殖的影响情况柱状图。图10A为不同浓度LPS对RAW264.7细胞释放NO的影响柱状图(横坐标为浓度，纵坐标为NO的浓度)。图10B为不同浓度CMP33对RAW264.7细胞释放NO的影响柱状图。图11为各组小鼠DAI评分柱状图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图12为各组小鼠结肠外观图。图13A为各组小鼠结肠长度柱状图。图13B为各组小鼠结肠结肠厚度柱状图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图14为各组小鼠宏观病理评分柱状图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图15A为对照组200倍显微镜下小鼠结肠HE染色图。图15B为模型组200倍显微镜下小鼠结肠HE染色图。图15C为低剂量CMP33用药组200倍显微镜下小鼠结肠HE染色图。图15D为高剂量CMP33用药组200倍显微镜下小鼠结肠HE染色图。图15E为阳性对照组SASP用药组200倍显微镜下小鼠结肠HE染色图。图15F为各组组织学评分图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图16为各组小鼠结肠组织中MPO活性柱状图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图17为各组小鼠结肠组织中MDA含量柱状图(与Normal组比较#p＜0.05，##p＜0.01；与Model组比较*p＜0.05，**p＜0.01)。图18A为各组小鼠结肠组织内细胞因子IFN-γ含量柱状图。图18B为各组小鼠结肠组织内细胞因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种羧甲基茯苓多糖CMP33的制备方法，其特征是所述多糖是利用DEAE‑52纤维素层析柱、Sephadex‑G200+Sephadex‑G150层析柱联用，对现有的羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1 mol/L NaCl溶液为洗脱液洗脱得到的羧甲基茯苓多糖CMP33。

【技术特征摘要】
1.一种羧甲基茯苓多糖CMP33的制备方法，其特征是所述多糖是利用DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex-G200+Sephadex-G150层析柱联用，对现有的羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，以0.1mol/LNaCl溶液为洗脱液洗脱得到的羧甲基茯苓多糖CMP33。2.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP44的制备方法，其特征在于所述现有羧甲基茯苓粗多糖由中国专利文献CN105348407A公开的羧甲基茯苓多糖的制备工艺制得。3.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP33的制备方法，其特征是所述多糖CMP33的单糖组成为D-葡萄糖，所述多糖分子量为15.23×104Da，结构为（1→3）-β-D-葡聚糖，含有（1→6）和（1→2）糖苷键，具有三螺旋结构。4.由权利要求1~3任一项所述制备方法制得一种羧甲基茯苓多糖CMP33。5.如权利要求4所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP33，其特征在于CMP33对自由基DPPH•、ABTS+、•OH的EC50值分别为3.62mg/mL、3.55mg/mL、2.31mg/mL。6.如权利要求1所述的一种羧甲基茯苓多糖CMP33，其特征是所述多糖CMP33在31.25-1000μg/mL浓度范围内对结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901以及肺癌细胞A549细胞增殖有抑制作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，刘晓菲，徐晓飞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44