一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节药物中的应用技术

本发明专利技术属于医药技术领域，具体涉及一种灵芝β‑葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节药物中的应用。灵芝β‑葡聚糖分子量为5～500kDa，单糖组成为葡萄糖和葡萄糖醛酸，两种单糖比例为30:1～4:1，其连接方式以→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→为主，两种连接方式比例为1:1～3:1。本发明专利技术通过将灵芝药材经过热水提取除去水溶性多糖后，残渣再用碱溶液进行提取，提取液用盐酸中和后，浓缩，经乙醇沉淀后得粗多糖。粗多糖经过阴离子交换树脂纯化，最终得到高纯度的β‑葡聚糖，通过细胞实验证明能显著促进RAW264.7细胞吞噬中性红，可用于制备免疫调节的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节药物中的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节药物中的应用。
技术介绍
灵芝多糖是灵芝中较为重要的活性成分之一，结构分析显示灵芝多糖主要以高分子量的糖聚合物为主，主要是由葡萄糖、木糖，甘露糖，半乳糖和岩藻糖等单糖形成地糖类大分子组成。不同来源及提取方式所获得地灵芝多糖，具有不同的单糖组成、分子量、分支构象和溶解性等特征，可以诱导多种免疫反应来发挥免疫调节效力。传统的灵芝多糖提取方法主要是水提醇沉，超声波辅助提取法，微波辅助提取法，酶法提取。中国专利CN102766221A公开一种灵芝多糖的提取方法，该方法包括复合酶酶解灵芝子实体、超声波处理和灵芝多糖提取。中国专利CN104292357A公开一种灵芝多糖的提取方法，该方法包括从灵芝中提取多糖，采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将灵芝中的脂肪、纤维素酶解，将其中的多糖提取出来，提高灵芝的利用率。中国专利CN104558227A公开一种灵芝多糖的提取方法，包括以下步骤：前处理、粗提取、冷冻提取、醇沉、除蛋白、脱色、超滤、真空干燥。以上3个专利均不涉及水提之后残渣的研究。灵芝是一种名贵的中药材，然而灵芝多糖提取率较低是亟待解决的问题，本专利技术对水提后的残渣进一步用碱液进行提取，提高灵芝的生物利用率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫调节的药物中的应用。本专利技术从赤灵芝水提后的残渣中进一步用碱液分离得到一种天然的β-葡聚糖，并用阴离子交换色谱柱纯化，最终得到高纯度的β-葡聚糖，通过细胞实验证明该种β-葡聚糖能显著促进RAW264.7细胞吞噬中性红，可用于制备免疫调节的药物。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案：一种灵芝β-葡聚糖，灵芝β-葡聚糖分子量为5～500kDa，单糖组成为葡萄糖和葡萄糖醛酸，两种单糖质量比例为30:1～4:1，其连接方式以→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→为主，两种连接方式比例为1:1～3:1。所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，以赤灵芝为原料，通过热水提取除去水溶性多糖，再用碱液进行提取，提取液用盐酸中和后，浓缩，经乙醇沉淀得到粗多糖；粗多糖经过阴离子交换树脂纯化，最终得到高纯度的葡聚糖。所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：(1)热水提取除去水溶性多糖：将赤灵芝粉碎过60目筛，加入蒸馏水，加热提取1～3次，每次1～3h，除去水溶性多糖，过滤脱水后，赤灵芝的药材残渣烘干；(2)提取得β-葡聚糖粗品水溶液：将步骤(1)所得药材残渣，加入碱溶液提取1～3次，以4000～5000r/min离心10～30min后，合并收集上清液，加入摩尔浓度0.5～1.5M的HCl水溶液，中和至上清液pH值为中性，将上清液真空减压浓缩至原体积的1/2～1/5；(3)乙醇沉淀得β-葡聚糖粗提物：向步骤(2)所得溶液中，加入2～5倍体积的95wt％纯度的乙醇，室温放置24～72h，以9000～11000r/min离心5～15min分离得固体沉淀，收集沉淀复溶冻干，即得β-葡聚糖粗提物；(4)粗品纯化得精制灵芝β-葡聚糖：将步骤(3)所得β-葡聚糖粗提物用蒸馏水溶解，以氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，经硫酸苯酚法检测，合并收集含有β-葡聚糖的组分，经过蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度灵芝β-葡聚糖。所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，步骤(1)中热水提取的料液质量比1:5～1:20，提取温度为60～90℃。所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，步骤(2)中碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或氢氧化铵的水溶液中至少一种，其摩尔浓度为：0.05～2M，碱提取的料液质量比为：1:3～1:20，提取温度为：-20℃～60℃，提取时间为：0.5～4h。所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，步骤(4)中氯化钠水溶液的摩尔浓度为0.1～2.5M；阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose)、DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)、DEAE-琼脂糖(DEAE-Sepharose)及QSephadexFastFlow中的至少一种。所述的灵芝β-葡聚糖在制备免疫调节药物中的应用，灵芝β-葡聚糖通过细胞实验证明能显著促进RAW264.7细胞吞噬中性红，用于制备免疫调节的药物，且在浓度为50～200μg/ml显示出较强免疫调节活性。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：(1)本专利技术原料为赤灵芝水提残渣，原料来源丰富，安全可靠，可以提高其生物利用率。(2)本专利技术采用的制备工艺简单，粗多糖产率可达1.5～5％。(3)采用本专利技术方法制备的β-葡聚糖，产品纯度高，分子量为5～500kDa，单糖组成为葡萄糖和葡萄糖醛酸，两种单糖比例为30:1～4:1，其连接方式以→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→为主，两种连接方式比例为1:1～3:1。(4)采用本专利技术所制备的β-葡聚糖通过细胞实验证明能显著促进RAW264.7细胞吞噬中性红，可用于制备免疫调节的药物。附图说明图1为本专利技术灵芝β-葡聚糖的GPC图。图中，横坐标time代表时间(min)，纵坐标relativescale代表相对峰面积。图2为本专利技术灵芝β-葡聚糖的核磁共振谱图。其中，图2(a)为该β-葡聚糖1HNMR图谱；图2(b)为该β-葡聚糖13CNMR图谱；图2(c)为该β-葡聚糖1H-1HCOSY图谱；图2(d)为该β-葡聚糖1H-13CHSQC图谱。图3为本专利技术五个葡萄糖所组成五糖的ESI-CID-MS2图。图中，横坐标m/z代表质荷比，纵坐标RelativeAbundance代表各碎片相对丰度。图4为本专利技术灵芝β-葡聚糖对小鼠RAW264.7细胞吞噬中性红能力的影响。图中，纵坐标OD540nm代表540nm处测各孔吸光度值。注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案进一步的详细说明，但本专利技术要求保护的范围并不局限于是实力表述的范围。实施例1：灵芝β-葡聚糖的制备本专利技术的灵芝β-葡聚糖的制备方法具体包括以下步骤：(1)热水提取除去水溶性多糖：将赤灵芝粉碎过60目筛，按料液质量比1:10加入蒸馏水，80℃加热提取2次，每次2h，除去水溶性多糖，赤灵芝的药材残渣烘干；(2)提取β-葡聚糖粗品：将步骤(1)所得药材残渣，按料液质量比1:10加摩尔浓度2M的NaOH水溶液，60℃加热提取1h，提取两次，离心(4500r/min，20min)合并收集上清液，加摩尔浓度1M的HCl水溶液，中和上清液，真空减压浓缩至原体积的1/3。(3)乙醇沉淀：向步骤(2)所得溶液中，加入4倍体积的95wt％纯度乙醇，室温放置48h，离心(10000r/min，10min)，收集沉淀复溶冻干，即得β-葡聚糖粗提物；(4)粗品纯化：将步骤(3)所得β-葡聚糖粗提物用蒸馏水溶解，以摩尔浓度0.2M的氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有葡聚糖组分，经过蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度β-葡聚糖。实施例2：灵芝β-葡聚糖的结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵芝β‑葡聚糖，其特征在于，灵芝β‑葡聚糖分子量为5～500kDa，单糖组成为葡萄糖和葡萄糖醛酸，两种单糖质量比例为30:1～4:1，其连接方式以→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→为主，两种连接方式比例为1:1～3:1。

【技术特征摘要】
1.一种灵芝β-葡聚糖，其特征在于，灵芝β-葡聚糖分子量为5～500kDa，单糖组成为葡萄糖和葡萄糖醛酸，两种单糖质量比例为30:1～4:1，其连接方式以→3)Glc(β1→及→6)Glc(β1→为主，两种连接方式比例为1:1～3:1。2.一种权利要求1所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，以赤灵芝为原料，通过热水提取除去水溶性多糖，再用碱液进行提取，提取液用盐酸中和后，浓缩，经乙醇沉淀得到粗多糖；粗多糖经过阴离子交换树脂纯化，最终得到高纯度的葡聚糖。3.根据权利要求2所述的灵芝β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)热水提取除去水溶性多糖：将赤灵芝粉碎过60目筛，加入蒸馏水，加热提取1～3次，每次1～3h，除去水溶性多糖，过滤脱水后，赤灵芝的药材残渣烘干；(2)提取得β-葡聚糖粗品水溶液：将步骤(1)所得药材残渣，加入碱溶液提取1～3次，以4000～5000r/min离心10～30min后，合并收集上清液，加入摩尔浓度0.5～1.5M的HCl水溶液，中和至上清液pH值为中性，将上清液真空减压浓缩至原体积的1/2～1/5；(3)乙醇沉淀得β-葡聚糖粗提物：向步骤(2)所得溶液中，加入2～5倍体积的95wt％纯度的乙醇，室温放置24～72h，以9000～11000r/min离心5～15min分离得固体沉淀，收集沉淀复溶冻干，即得β-葡聚糖粗提物；(4)粗品纯化得精制灵芝β-葡聚糖：将步骤(3)所得β-葡聚糖粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：于广利，顾菲菲，蔡超，郝杰杰，李佳，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37