一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种OX40基因修饰人源化动物模型的制备方法，该方法利用CRIPSR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组的方式将小鼠OX40基因的外显子1－7替换为人OX40基因片段，从而制备出基因修饰人源化小鼠，该小鼠能正常表达含有人OX40蛋白功能域的蛋白，可以作为OX40信号机理研究，调节剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究OX40基因的功能，以及新药研发具有重要的应用高价值。

【技术实现步骤摘要】
一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用
本专利技术涉及动物模型领域，尤其涉及一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用。
技术介绍
人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。研究人类复杂疾病的发病机制，筛选有效药物，需要理想的动物模型来进行大量的体内试验。小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大、小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，是进行一些人类疾病研究的方法。OX40，别名TNFRSF4(TumorNecrosisFactorReceptorSuperfamilyMember4)或者CD134，是TNFR/TNF超家族的一个极其重要的受体分子。OX40在CD4+和CD8+T细胞免疫应答中起重要作用，其影响T细胞依赖的B细胞的增殖和分化，此外OX40还促进凋亡抑制剂BCL2andBCL2lL1/BCL2-XL的表达，从而抑制细胞凋亡。临床研究表明，OX40的激动可导致免疫效应和记忆功能的刺激，减少免疫抑制调节性T细胞(多出现在肿瘤中)。OX40激动剂在癌症中的作用已日益受到重视，目前多种激动剂处于研发阶段或已开始在临床试验中用于癌症治疗。为了使临床前期的试验更有效并使治疗失败最小化，提供一种OX40基因人源化的改造动物模型非常重要，目前尚缺乏真正意义上的OX40基因人源化小鼠。虽然有文献报道制备人源化OX40基因的动物模型，但是其动物模型中OX40基因并未实现全部外显子的人源化，仅仅制备了第1号外显子的部分序列、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子的部分序列来自人源的OX40基因动物模型。这种动物模型还是未做到OX40基因及其表达产物尽可能与人相同的效果。我们构建了针对mouseOX40基因的gRNA和携带humanOX40片段的Donorvector，利用CRISPR/Cas9技术和囊胚注射技术，将mouseOX40基因的E1-7codingregion替换为humanOX40片段。在替换的同时保留了mouseOX40基因的UTR区域，保证了humanOX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。同时，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括gRNA等进行了充分的优化和调整，保证采用该技术制备人源化OX40基因动物模型的成功率和准确率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人源化小鼠OX40基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。还提供了包含权利要求1所述DNA序列的载体。提供所述DNA序列或所述载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。本专利技术还提供一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；(2)将人源OX40基因的DNA序列、鼠源OX40基因的3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化OX40基因的载体。(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产OX40基因修饰人源化鼠模型；所述载体能够将鼠源OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人源OX40的片段，在替换的同时保留鼠源OX40基因的UTR区域，保证人源OX40表达受鼠自身启动子和调控序列控制。优选地，其中针对鼠源OX40基因的sgRNA的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO:2所示。优选地，其中步骤(2)中所述5’同源臂通过引物对SEQIDNO:7和SEQIDNO:8扩增小鼠基因组DNA获得，所述3’同源臂通过引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10扩增小鼠基因组DNA获得。优选地，所述载体的制备步骤如下：①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；③以pMD18-Tvector为模板，利用引物对SEQIDNO:13和SEQIDNO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒HumanOX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；⑤酶切HumanOX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnasefree的水中，直接用于注射。优选地，其中步骤(1)中构建表达sgRNA的质粒的过程如下：1)BsaI线性化pUC57-gRNA-T7载体，并用CIAP去磷酸化；2)退火：序列如SEQIDNO：3和4的上下游引物、以及序列如SEQIDNO：5和6的上下游引物分别稀释成100umol，退火；3)加磷酸：退火产物进行加磷酸处理4)连接：取加磷酸后的产物与线性化并去磷酸处理的pUC57-gDNA-T7进行连接，分别获得表达序列如SEQIDNO：1所示的sgRNA的质粒1和序列如SEQIDNO：2所示的sgRNA的质粒2。优选地，所述方法进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的步骤本专利技术还提供所述的DNA序列或者所述制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法在评估靶向OX40的药物有效性、OX40靶向药物筛选开发、免疫检查点肿瘤药物联用的开发、或OX40靶向药物的毒理研究中的应用。另外，本专利技术还提供了特异性靶向小鼠OX40基因的sgRNA，其序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术具有以下积极效果：1、本专利技术的动物模型，其OX40基因的第1－7号外显子全部被人为替换成人源OX40基因第1－7外显子，同时保留小鼠OX40基因的UTR区域，能在动物体内表达含有人OX40蛋白功能域的OX40蛋白，同时保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。采用本方法能最大程度减少人源化可能造成的基因转录的影响；同时使表达出的蛋白最大程度的接近人OX40蛋白。2、本专利技术提供了优化的制备人源OX40基因动物模型的具体操作方法，该方法中优化了sgRNA、donorvector的制备，确保了动物模型的成功率。3、本专利技术的方法制备的OX40基因修饰人源化动物模型可作为标准的模型动物，应用于OX40信号机理研究。可作为标准的模型动物，接种C57BL6背景的同源性肿瘤进行造模，如接种MC38、B16F10等细胞系，造模后可应用于：A.OX40靶向药物筛选开发；B.免疫检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化小鼠OX40基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。

【技术特征摘要】
1.一种人源化小鼠OX40基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。2.包含权利要求1所述DNA序列的载体。3.权利要求1所述的DNA序列或权利要求2所述的载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。4.一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；(2)将人源OX40基因的DNA序列、鼠源OX40基因的3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化OX40基因的载体。(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产OX40基因修饰人源化鼠模型；所述载体能够将鼠源OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人源OX40的片段，在替换的同时保留鼠源OX40基因的UTR区域，保证人源OX40表达受鼠自身启动子和调控序列控制。5.如权利要求4所述的方法，其中针对鼠源OX40基因的sgRNA的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO:2所示。6.如权利要求4或5所述的方法，其中步骤(2)中所述5’同源臂通过引物对SEQIDNO:7和SEQIDNO:8扩增小鼠基因组DNA获得，所述3’同源臂通过引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10扩增小鼠基因组DNA获得。7.如权利要求4或5所述的方法，所述载体的制备步骤如下：①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、引物对SEQIDNO:9和SEQIDNO:10进行PCR，得到特异的P...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，琚存祥，张明坤，杨笑柳，侯欢欢，高翔，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32