一种翘嘴鳜TLR3基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种翘嘴鳜TLR3基因及其应用。该TLR3基因的cDNA序列核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该TLR3基因的gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，该TLR3基因的氨基酸序列如SEQID NO：3所示。本发明专利技术TLR3基因可分别用于翘嘴鳜病原感染初期检测，为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益；此外，本发明专利技术TLR3基因还可用于翘嘴鳜抗病种质选育方面，为翘嘴鳜的选育工作提供新思路，有利于推进翘嘴鳜的遗传育种进程，提高鳜鱼养殖经济效益。

A TLR3 Gene of Siniperca chuatsi and Its Application

The present invention discloses a TLR3 gene of Mandarin eel and its application. The nucleotide sequence of the TLR3 gene is shown as SEQ ID NO:1, the gDNA nucleotide sequence of the TLR3 gene is shown as SEQ ID NO:2, and the amino acid sequence of the TLR3 gene is shown as SEQID NO:3. The TLR3 gene of the present invention can be used for the early detection of pathogenic infection of Siniperca chuatsi, which provides a new idea for the early diagnosis of Siniperca chuatsi infected by virus or bacteria, is conducive to the early prevention and control of fish diseases, and improves the economic benefits of Siniperca chuatsi breeding. In addition, the TLR3 gene of the present invention can also be used for the breeding of Siniperca chuatsi resistant germplasm, and provides a new idea for the breeding of Siniperca chuatus chuatsi, and is conducive to pushing forward. The process of genetic breeding of Mandarin eel (Siniperca chuatsi) can improve the economic benefit of Mandarin eel culture.

【技术实现步骤摘要】
一种翘嘴鳜TLR3基因及其应用
本专利技术属于水产养殖、生物
，尤其涉及一种翘嘴鳜TLR3基因及其在翘嘴鳜被病原感染初期的检测和翘嘴鳜抗病种质选育方面的应用。
技术介绍
翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca)，是我国的名贵经济鱼类和重要淡水养殖品种。然而随着近年来人工养殖规模的不断扩大，翘嘴鳜的种质退化、抗病能力下降等现象比较普遍，导致病毒性等疾病的曝发日益猖獗，而且至今未有十分有效的防治方法，每年都造成严重的经济损失，严重制约了其养殖业的可持续发展。因此，对于翘嘴鳜被病原感染的早期检测诊断以及抗病种质的选育是防治其病害曝发的重要手段。现有鱼类被感染病毒或细菌病原的检测诊断是根据鱼类的发病症状进行初步判断，然后解剖取病样组织提取病原，再将其提纯、鉴定后进行活体攻毒实验，才能确诊是否是发病病原，且由于可能是多种病原或未知病原引起的疾病，难以做出判断。不但耗时费力、操作困难，而且由于被感染病毒或细菌病原初期的鱼类无任何发病症状，因此现有的技术无法在鱼类被病毒或细菌病原感染初期对其做出正确的检测，错失了最佳病害防治时机，导致病害防治效果不理想。开展与抗病相关基因的cDNA全长序列克隆，并利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)定性和定量检测抗病相关基因的表达，根据被感染病毒或细菌病原初期的鱼类会激活体内抗病相关基因(分子标记)大量表达的原理，通过检测并分析抗病相关基因表达量的变化，可作为翘嘴鳜被感染病原的早期辅助诊断依据，是提高翘嘴鳜病害防治效果的有效手段。其中，qPCR技术是分析基因表达谱的一种常用的方法技术，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号在扩增反应中的循环累积实时监测整个PCR进程，最终通过特定数学原理对未知模板进行定量及定性分析，具有灵敏性高、特异性强、快速准确等特点，可以分析特定基因在不同时期或不同处理样本间的基因表达差异等，是一种强有力的检测基因表达的方法。现有鱼类选育技术是根据肉眼观察到的鱼类表观性状对鱼类进行选育，无法从与表观性状密切相关的基因(遗传分子)差异角度对鱼类进行正确的选育，不仅无法开展早期选育、后代的性状难以保证，而且选育的盲目性大、费时费力。开展与抗病相关基因的gDNA全长序列克隆，并利用SNP分子标记检测或筛选抗病的翘嘴鳜种质资源，进而选育出抗病种群。其中，SNPs(单核苷酸多态性)是指基因(gDNA)片段上的单个碱基发生转换、颠换、插入或缺失，会使得SNP表现出多态性，也会导致生物个体间的抗病性等表型出现差异。具有灵敏性高、特异性强、快速准确等特点，是提高鱼类优良性状选育效率的有效手段。在抗病相关基因中，TLRs(Toll样受体)是单一的、非催化的、膜生成的模式识别受体(PRRs)，能特异性识别各种微生物(病原体)的相关分子模式(PAMP)并将其激活和表达，进而启动细胞天然免疫信号通路。TLR3是TLRs中最重要的一类，定位于细胞的核内体中，在鱼类中是识别病毒双链RNA(dsRNA)和G+细菌、G-细菌的受体，并参与鱼类抗病原免疫反应。例如，草鱼TLR3能够有效参与抗病毒和机体防御过程，在对抗草鱼病毒性疾病和调节免疫保护中有重要的作用。此外，TLR3也参与了被细菌感染的防御，例如：小鼠被注射LPS后，其体内TLR3显著上调。但目前有关鱼类TLR3基因克隆和功能的相关研究还比较缺乏。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种翘嘴鳜抗病基因TLR3(Toll样受体-3)全长序列，包括TLR3cDNA和TLR3gDNA。TLR3是TLR家族中最重要的成员之一，鱼类TLR3是识别病毒双链RNA(dsRNA)和G+细菌、G-细菌的受体，并参与鱼类抗病原免疫反应，而有关鱼类TLR3基因还很少，克隆重要的经济鱼类翘嘴鳜TLR3基因全长序列，对于进一步研究鱼类TLR系统的抗病分子机制及其应用具有重要价值。本专利技术的再一目的在于提供上述TLR3cDNA序列在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用，该应用基于TLR3基因mRNA的表达来早期检测翘嘴鳜被感染病原的辅助诊断技术，通过在本专利技术翘嘴鳜TLR3cDNA克隆的基础上，采用qPCR技术在翘嘴鳜被感染病毒或细菌的数小时至数天内，通过检测出鱼体内头肾中TLR3的表达量，可初步诊断翘嘴鳜是否受到病毒或细菌感染，为鱼类病害的早期防治提供较为可靠的依据，进而增加鱼类养殖的经济效益。本专利技术的另一目的在于提供上述TLR3gDNA在翘嘴鳜抗病种质选育方面的应用，该应用以本专利技术所发现的翘嘴鳜TLR3gDNA为基础，将其基因单核苷酸多态性(SNPs)与鱼类表观性状相结合，以抗病或非抗病鱼类TLR3的SNP标记(或称突变位点)为依据，可选育出抗病鱼类种群，提高优种选育的工作效率，降低选育鱼类的发病率和死亡率，这对于鱼类选育的技术进步具有非常重要的意义。本专利技术是这样实现的，一种翘嘴鳜TLR3基因，该基因的cDNA序列核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。优选地，该基因的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术进一步公开了一种翘嘴鳜TLR3蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术进一步公开了上述翘嘴鳜TLR3基因在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用。优选地，该应用具体包括以下步骤：(1)根据翘嘴鳜体内TLR3-TRIF依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR3-TRIF依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR3、TRAF6、TAK1和ikkβ基因的cDNA序列；(2)在翘嘴鳜感染病毒或细菌初期，采用qPCR检测方法对TLR3-TRIF依赖型抗病信号通路相关基因mRNA表达量的显著应答反应进行检测和分析，将检测结果作为鱼体被病毒或细菌感染初期的辅助指标。本专利技术进一步公开了上述翘嘴鳜TLR3基因在翘嘴鳜抗病种质选育方面的应用。优选地，该应用具体包括以下步骤：(1)根据TLR3基因的cDNA序列克隆出TLR3基因的gDNA序列；(2)根据该gDNA序列设计用于扩增抗病SNP位点的引物，扩增翘嘴鳜TLR3基因获得扩增产物；(3)对扩增产物进行测序并找出与病毒疾病抗性相关的疑似SNPs位点，根据DNA峰形图确定出SNP位点，将确定的SNP位点作为翘嘴鳜抗病种质选育的分子标记。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术首次克隆了翘嘴鳜TLR3cDNA全长序列、TLR3gDNA全长序列，为鱼类的抗病选育等工作提供研发基础；(2)本专利技术建立了翘嘴鳜TLR3基因的qPCR检测技术，基于发现的翘嘴鳜被病毒或细菌感染的数小时至数天内体内头肾中TLR3基因mRNA表达量极显著(P<0.01)变化的规律，作为翘嘴鳜被病原早期感染的辅助诊断技术，为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益；(3)本专利技术检测到了鳜鱼TLR3gDNA基因与病毒疾病抗性相关的SNP位点，为翘嘴鳜的选育工作提供新思路，有利于推进翘嘴鳜的遗传育种进程，提高鳜鱼养殖经济效益。附图说明图1是翘嘴鳜TLR3基因各阶段扩增后的凝胶电泳结果；其中，图1(A)是翘嘴鳜TLR3基因cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种翘嘴鳜TLR3基因，其特征在于，该基因的cDNA序列核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种翘嘴鳜TLR3基因，其特征在于，该基因的cDNA序列核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的翘嘴鳜TLR3基因，其特征在于，该基因的gDNA核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种翘嘴鳜TLR3蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。4.权利要求1所述的翘嘴鳜TLR3基因在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用具体包括以下步骤：(1)根据翘嘴鳜体内TLR3-TRIF依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR3-TRIF依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR3、TRAF6、TAK1和ikkβ基因的cDNA序列；(2)在翘...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹤忠，路瑶，叶金明，肖攀，李泽，金锐铭，董同瑚，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32