编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法。编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸如SEQ ID NO.4所示。载体的构建方法包括提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，合成二点委夜蛾触角cDNA；气味受体基因ORCO的克隆、回收、纯化；构建二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS‑ORCO。本发明专利技术通过获取并分析一种编码农业害虫二点委夜蛾气味受体基因ORCO的基因序列，开发出一种可在非洲爪蟾卵母细胞中表达成蛋白质的载体构建方法，为后续鉴定该基因的确切生理功能提供可能，也为了解蛾类害虫嗅觉感受的作用机制及开发新型杀虫剂提供理论基础。

Construction of genes encoding insect odor receptors and expression vectors of frog eggs

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a construction method of a gene encoding insect odor receptor and a frog egg expression vector thereof. The gene encoding insect odor receptor is ORCO. The nucleotide sequence of ORCO is shown in SEQ ID NO. 3 and the amino acid is shown in SEQ ID NO. 4. The construction methods of vectors include extracting total RNA from adult antennae of Spodoptera exigua, synthesizing DNA from the antennae of Spodoptera exigua, cloning, recycling and purifying the odor receptor gene ORCO, and constructing the odor receptor gene ORCO frog egg expression vector pT7TS ORCO. By acquiring and analyzing a gene sequence encoding the odor receptor gene ORCO of the agricultural pest Spodoptera exigua, the present invention develops a vector construction method for expressing protein in Xenopus laevis oocyte, which provides a possibility for subsequent identification of the exact physiological function of the gene, as well as a theoretical basis for understanding the mechanism of olfactory sensation of moth pests and developing new insecticides. Foundation.

【技术实现步骤摘要】
编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法。
技术介绍
昆虫气味受体分为传统气味受体(traditionalodorantreceptor)和非典型的气味受体(atypicalodorantreceptor)。传统嗅觉受体包括普通的气味受体(odorantreceptor)和性信息素受体(pheromonereceptor)，在不同昆虫间具有较低同源性，而非典型的气味受体ORCO主要在成虫触角中表达，且在不同种间序列和功能均高度保守。气味受体ORCO不与气味识别或结合，但对离子通道的形成意义重大，它与传统气味受体形成复合体ORX-ORCO，能极大促进气味分子与受体得特异结合。此前有研究显示，在昆虫中将ORCO基因沉默后，突变体对气味都不敏感，当转入OR基因拯救后又恢复正常，表明在昆虫气味识别过程中ORCO基因具有至关重要的作用。因此研究该基因的作用机制等有助于了解昆虫的生理功能，为开发新型杀虫剂提供理论基础。基因功能的研究极大的依赖于载体及表达系统的构建，一个稳定性高的表达载体可高效表达目的基因，获得大量的蛋白质，为实验研究提供极大的便利。然后现有技术中缺乏稳定性高的气味受体基因ORCO的表达载体，导致表达载体转化入细胞后，阳性克隆细胞得率低。
技术实现思路
本专利技术提供的一种编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法，构建出了稳定的气味受体基因ORCO表达载体，阳性克隆细胞得率在90％以上。本专利技术的第一个目的是提供一种编码昆虫气味受体的基因，编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸如SEQIDNO.4所示。本专利技术的第二个目的是提供一种利用编码昆虫气味受体的基因构建蛙卵表达载体的方法，包括以下步骤：S1，提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，合成夜蛾触角cDNA；S2，气味受体基因ORCO的克隆、回收、纯化以二点委夜蛾cDNA为模板，以反向引物5’-TCAACTAGTGCCACCATGATGACCAAAGTGAAGACCCAG-3’，正向引物5’-TCACTCGAGTTACTTGAGTTGCACCAACACCAT-3’进行PCR扩增，对PCR产物进行回收、纯化；S3，构建二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS-ORCO将pT7TS载体经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到pT7TS酶切产物；将S2回收的PCR产物经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到夜蛾酶切产物；将pT7TS酶切产物和夜蛾酶切产物连接，得到二点委夜蛾ORCO基因蛙卵表达载体pT7TS-ORCO。优选的，上述的构建蛙卵表达载体的方法，S2中，PCR扩增体系如下：1μl夜蛾cDNA、2.5μl10×ExPCRBuffer、0.5mmol/LdNTP、GSPs0.4μmol/L、UPM/NUPM1μmol/L和2.5UTaqDNA聚合酶；PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性50s，70℃退火1min，72℃延伸1min，退火温度从70℃降至60℃，每个循环降1℃，然后60℃维持1min，循环25次；72℃延伸10min，4℃保持。优选的，上述的构建蛙卵表达载体的方法，将二点委夜蛾ORCO基因蛙卵表达载体pT7TS-ORCO转化至感受态细胞，保存备用。优选的，上述的构建蛙卵表达载体的方法，所述感受态细胞为Trans-T1感受态细胞。与现有技术相比，本专利技术的编码昆虫气味受体的基因及其蛙卵表达载体的构建方法，具有以下有益效果：本专利技术通过获取并分析一种编码农业害虫二点委夜蛾气味受体基因ORCO的基因序列，开发出一种可在非洲爪蟾卵母细胞中表达成蛋白质的载体构建方法，阳性克隆细胞得率在90％以上，这为后续鉴定该基因的确切生理功能提供可能，也为了解蛾类害虫嗅觉感受的作用机制及开发新型杀虫剂提供理论基础。本专利技术基于二点委夜蛾气味受体基因ORCO片段信息，设计基因特异性引物，并克隆出该基因cDNA全长序列，进行序列分析和同源性比较，得出该基因全长1422bp，氨基酸序列与棉铃虫ORCO(Helicoverpaarmigera)、烟青虫ORCO(Heliothisassulta)的嗅觉受体具有较高的同源性，这也验证了该基因在昆虫间的高度保守性。二点委夜蛾气味受体基因ORCO的成功克隆，对后续功能分析及嗅觉机制的研究有重要帮助，目前有研究表明，气味受体基因ORCO能促进气味分子与受体之间的结合，并能帮助传统气味受体正确定位到嗅觉神经元的树突膜上。从应用方面来看，ORCO基因对于嗅觉的重要性，可能成为破坏嗅觉的靶目标，通过破坏二点委夜蛾的气味受体ORCO来影响其觅食、繁殖、交配等生命活动，为新型农业防治措施提供新思路。附图说明图1是二点委夜蛾的气味受体基因ORCO跨膜区分析图；图2为二点委夜蛾的气味受体基因ORCO与其他昆虫气味受体蛋白的序列对比；图3为二点委夜蛾的气味受体基因ORCO全长序列的PCR扩增电泳图；其中，M：DNAmarker，A：气味受体基因ORCO；图4为二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS-ORCO的PCR电泳检测图；其中，M：DNAmarker，从上到下依次为2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp；1：阴性克隆；2：阳性克隆。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。本专利技术提供的一种编码昆虫气味受体的基因，编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸如SEQIDNO.4所示。气味受体基因ORCO蛙卵表达载体的构建方法，包括以下实施例。下述实施例中所用材料和试剂如下：供试昆虫：从田间收集二点委夜蛾幼虫在实验室内培养，采用棉铃虫的饲养配方，控制培养环境温度为(26±1)℃、相对湿度70％左右、光周期L14h//10h左右，之后收取雄虫成虫触角于液氮中备用。主要试剂：表达载体pT7TS(Invitrogen，美国，由中国农科院植物保护研究所赠送)，cRNA合成试剂盒mMESSAGEmMACHINET7(Ambion，Austin，TX)，细胞24孔培养板(NEST，中国)，TaqDNA聚合酶、M-MLV反转录酶；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；PCR引物由南京金斯瑞生物技术有效公司合成；其他试剂为国产AR级或进口分装AR级产品。实施例1一种编码昆虫气味受体的基因(ORCO)蛙卵表达载体的构建方法，包括以下步骤：S1，提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，并合成二点委夜蛾cDNA；S11，提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA：用SVTotalRNAIsolation试剂盒进行总RNA提取，获得二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA。S12，合成二点委夜蛾cDNAS121，5′-RACEcDNA第一链的合成以二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA为模板，依据ClontechTMSmarter反转录试剂盒的操作步骤，进行5’-r本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码昆虫气味受体的基因，其特征在于，编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码昆虫气味受体的基因，其特征在于，编码昆虫气味受体的基因为气味受体基因ORCO，ORCO的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸如SEQIDNO.4所示。2.一种利用权利要求1所述的编码昆虫气味受体的基因构建蛙卵表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取二点委夜蛾雄虫成虫触角总RNA，并合成二点委夜蛾cDNA；S2，气味受体基因ORCO的克隆、回收、纯化以二点委夜蛾cDNA为模板，以反向引物5’-TCAACTAGTGCCACCATGATGACCAAAGTGAAGACCCAG-3’，正向引物5’-TCACTCGAGTTACTTGAGTTGCACCAACACCAT-3’进行PCR扩增，对PCR产物进行回收、纯化；S3，构建二点委夜蛾气味受体基因ORCO蛙卵表达载体pT7TS-ORCO将pT7TS载体经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到pT7TS酶切产物；将S2回收的PCR产物经BglⅡ和SpeⅠ双酶切，得到夜...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚楠，朱秀云，贺鹏，徐继伟，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34