一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，为一种替换猪CD163第七外显子后可有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，同时还公开了该序列在抗病研究中的应用，利用CRISPR/Cas9技术；将基因序列如SEQ ID 1所示的猪CD163第五外显子基因序列成功地替换猪CD163第七外显子的基因序列，并获得了CD163基因序列如SEQ ID 2的阳性克隆猪的肺泡巨噬细胞；可用于阐明PRRSV感染的分子机制及为后续获得有效抑制PRRSV感染的猪种群提供了理论基础，减少因PRRSV给养猪业带来的巨大损失。

【技术实现步骤摘要】
一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列及其应用
本专利技术公开了一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，为一种替换猪CD163第七外显子后可有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，同时还公开了该序列在抗病研究中的应用，属于生物工程

技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的世界性的传染病，PRRS的主要表征为母猪繁殖力低，妊娠母猪流产，仔猪和育肥猪发生肺炎，并伴随着呼吸障碍，仔猪生长缓慢等；此外，还会带来严重的免疫抑制和持续性感染。在我国1996年首次发现该病，2006年以来，高致病变异株的出现使得该病在中国大规模的爆发，每年都会给养猪业造成严重的经济损失。根据基因型的不同，PRRSV主要可以分为两个亚型：Ⅰ型（欧洲型）和Ⅱ型（美州型）。由于PRRSV毒株变异速度快；PRRSV与宿主之间存在抗体依赖性增强现象；这些因素导致了在世界范围内疫苗免疫保护机制不能有效的对猪群提供免疫保护。
技术实现思路
本专利技术公开了一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，并制备了含有这段基因序列的克隆猪。实验结果表明用这段基因序列替换猪CD163第七外显子后的PAMs可有效的在体外抑制Ⅱ型PRRSV的感染。本专利技术公开的一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，其特征在于：基因序列如SEQID1所示；基因修饰后的CD163基因序列如：SEQID2所示；能有效扩增该目的基因的上游引物序列F1如：SEQID3所示，下游引物序列R1如：SEQID4所示；能有效扩增CD163第七外显子上游基因5-HA的上游引物序列F2如：SEQID5所示，下游引物序列R2如：SEQID6所示，扩增出的基因序列5-HA如：SEQID7所示；能有效扩增CD163第七外显子下游基因3-HA的上游引物序列F3如：SEQID8，下游引物序列R3如：SEQID9所示，扩增出的基因序列如：SEQID10所示。将SEQID1，SEQID7，SEQID10重组连接得到的序列如SEQID19所示。本专利技术能有效编辑猪CD163基因簇的sgRNA的DNA序列，其特征在于：sgRNA1的DNA序列如SEQID11所示，互补链的DNA序列如：SEQID12所示，sgRNA1的RNA序列如SEQID13所示，互补链的RNA序列如：SEQID14所示；sgRNA2的DNA序列如SEQID15所示，互补链的DNA序列如：SEQID16所示，sgRNA1的RNA序列如SEQID17所示，互补链的RNA序列如：SEQID18所示。本专利技术所述的一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列的制备方法，包括以下步骤：1）在NCBI基因库中调出猪CD163基因序列；2）利用Primer5软件设计得到碱基序列分别如SEQID3，SEQID4所示的上游引物F1和下游引物R1；3)利用PCR体外扩增方法得到碱基序列如SEQID1所示的目的基因序列；4)在NCBI基因库中调出猪CD163基因序列；5）利用Primer5软件设计得到碱基序列分别如SEQID5，SEQID6，SEQID8，SEQID9所示的上游引物F2，R2和下游引物F3，R3；6）利用PCR体外扩增方法得到碱基序列如SEQID7；SEQID10所示的目的基因上下游基因；7）将上述所获得的碱基序列如SEQID1，SEQID7，SEQID10的基因等比加入含SEQID5，SEQID9的PCR体系中；8）通过PCR技术，体外重组连接这三个片段，得到序列如SEQID19所示的同源替换载体；9）将构建的sgRNA质粒：SEQID11、SEQID12、SEQID14、SEQID15与同源打靶载体SEQID19共转染进猪胎儿成纤维细胞PFF，并通过有限稀释法，筛选鉴定得到阳性同源替换的猪胎儿成纤维细胞，该阳性成纤维细胞CD163基因序列如SEQID2所示。本专利技术所述的一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列。其特征在于：所述的基因序列SEQID1定点替换猪CD163第七外显子后得到基因序列如SEQID2所示。分离得到的CD163基因序列如SEQID2所示的阳性克隆猪原代肺泡巨噬细胞可有效的抑制Ⅱ型PRRSV的复制，并为后续阐明PRRSV感染机制研究及为获得可有效抑制PRRSV感染的猪群提供了理论基础。本专利技术的积极效果在于：利用CRISPR/Cas9技术，将基因序列如SEQID1所示的猪CD163第五外显子基因序列成功地替换猪CD163第七外显子的基因序列，并获得了CD163基因序列如SEQID2的阳性克隆猪的肺泡巨噬细胞；可用于阐明PRRSV感染的分子机制及为后续获得有效抑制PRRSV感染的猪种群提供了理论基础，减少因PRRSV给养猪业带来的巨大损失。附图说明：图1：用于评估CD163exon7位点的sgRNA切割效率的测序峰图；图2：定点打靶猪胎儿细胞阳性克隆的测序图和RFLP电泳图；图3：绝对荧光定量PCR结果。具体实施方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1如SEQID1所示的可有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列的制备1）在NCBI基因库中调出猪CD163基因序列；2）利用Primer5软件设计得到碱基序列分别如SEQID3，SEQID4所示的上游引物F1和下游引物R1；3)利用PCR体外扩增方法得到碱基序列如SEQID1所示的目的基因序列；实施例21-1、sgRNA序列的设计及PX330表达载体的构建设计并合成了2条针对猪CD163exon7位点的sgRNA序列。上述设计完成的sgRNA序列合成；4条单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成2条靶向猪CD163exon7不同位点的sgRNA的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连连入PX330质粒载体。这2条sgRNA的序列及其作用位点的序列分别为：SgRNA-1序列：5-GGAAACCCAGGCTGGTTGGA-3SgRNA-1作用位点的序列：5-TCCAACCAGCCTGGGTTTCC-3SgRNA-2序列：5-GAGTAGCACCCCGCCCTGAC-3SgRNA-2作用位点的序列：5-GTCAGGGCGGGGTGCTACTC-3其中，本专利技术所涉及的SgRNA-1的RNA序列为：5-GGAAACCCAGGCUGGUUGGA-3SgRNA-1的RNA序列的互补序列为：5-UCCAACCAGCCUGGGUUUCC-3其中，本专利技术所涉及的SgRNA-2的RNA序列为：5-GAGUAGCACCCCGCCCUGAC-3SgRNA-2的RNA序列的互补序列为：5-GUCAGGGCGGGGUGCUACUC-3。1-2、高效sgRNA的评估和筛选通过对构建的2种PX330-sgRNA表达载体测序验证后，提取目的质粒和进行乙醇沉淀，将纯化后一定浓度的三种PX330-sgRNA表达载体，通过电穿孔转染的方式引入到猪胎儿成纤维细胞中，转染72小时后，提取各组细胞的基因组，然后用特异性的检测突变效率的引物进行PCR反应，将所获得的PCR产物送去测序通过对测序峰图的分析初步评估个s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，其特征在于：基因序列如SEQ ID 1所示；基因修饰后的CD163基因序列如：SEQ ID 2所示。

【技术特征摘要】
1.一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列，其特征在于：基因序列如SEQID1所示；基因修饰后的CD163基因序列如：SEQID2所示。2.如权利要求1所述的一种有效抑制Ⅱ型PRRSV感染的基因序列的制备方法，包括以下步骤：1）在NCBI基因库中调出猪CD163基因序列；2）利用Primer5软件设计得到碱基序列分别如SEQID3，SEQID4所示的上游引物F1和下游引物R1；3)利用PCR体外扩增方法得到碱基序列如SEQID1所示的目的基因序列；4)在NCBI基因库中调出猪CD163基因序列；5）利用Primer5软件设计得到碱基序列分别如SEQID5，SEQID6，SEQID8，SEQID9所示的上游引物F2，R2和下游引物F3，R3；6）利用PCR体外扩增方法得到碱基序列如SEQID7；S...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，袁泓明，逄大欣，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22