多浪羊的Lin28B基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了多浪羊的Lin28B基因及其应用，它是从多浪羊组织中克隆的、调控初情期启动的Lin28B基因，它具有序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的两个核苷酸序列，可应用于调控多浪羊初情期的启动。本发明专利技术可从遗传上人为缩短绵羊的初情期年龄，对我国养羊业的发展有非常重要的意义和巨大的潜在经济价值。

【技术实现步骤摘要】
多浪羊的Lin28B基因及其应用
本专利技术专利属于动物基因工程领域，具体涉及多浪羊的Lin28B基因。
技术介绍
母羊初情期是正常母羊第一次表现发情并排卵时的年龄，是获得繁殖能力的标志，遗传是影响母羊初情期的主要因素。目前，初情期启动研究集中在人、小鼠和猴上面，绵羊初情期启动研究还很少。近年来利用全基因组关联分析(GWAS)、转基因等研究发现Lin28B基因在人青春期及小鼠、山羊等哺乳动物初情期启动中具有重要调节作用，但在绵羊初情期启动中的作用研究还未见报道。Lin28B基因首先在人上被克隆出来，目前人、小鼠、牛、马、猫、猪等Lin28B基因已被克隆出来，但到目前为止，尚未见到关于多浪羊Lin28B基因克隆和功能的研究报道，而其对于绵羊初情期启动的调控作用更是未知。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了多浪羊的Lin28B基因及其应用。本专利技术所采用的技术方案如下。多浪羊的Lin28B基因，其特征在于，它是从多浪羊组织中克隆的、调控初情期启动的Lin28B基因，它具有序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的两个核苷酸序列；其中，SEQIDNO：1的长度为6630bp、编码247个氨基酸，SEQIDNO：2的长度为5271bp、编码255个氨基酸。进一步的，所述从多浪羊组织克隆采用的引物如下表所示：多浪羊的Lin28B基因的应用，其特征在于，应用于调控多浪羊初情期的启动。本专利技术的有益效果：本专利技术以性早熟的多浪羊为研究对象，对其lin28B基因序列克隆，采用Real-timePCR技术，分析下丘脑、垂体及卵巢中lin28B基因在多浪羊初情期启动过程中的表达变化，以进一步揭示lin28B基因在多浪羊初情期启动中的作用，为从遗传上人为缩短绵羊的初情期年龄提供科学依据，为通过遗传手段改变绵羊性成熟时间、提高繁殖性能而奠基，对我国养羊业的发展有非常重要的意义和巨大的潜在经济价值。附图说明图1为多浪羊组织中提取出的总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图2为多浪羊Lin28Bcds扩增电泳图；图3为多浪羊Lin28B3'UTRX扩增电泳图；图4为多浪羊初情期启动过程中Lin28B基因在下丘脑中表达的变化规律图；图5为多浪羊初情期启动过程中Lin28B基因在垂体中表达的变化规律图；图6为多浪羊初情期启动过程中Lin28B基因在卵巢中表达的变化规律图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本专利技术所做的解释性说明，但本专利技术的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本专利技术的精神对本专利技术所做的等效的替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1Lin28B基因片段的扩增、模板回收、连接转化、测序。根据提供的样品组织，分别用TRIZOL方法提取总RNA，并用Thermo的cDNA反转录试剂盒MaximaTMHMinuscDNASynthesisMasterMix(M1662)反转录，具体步骤如下。1、PCR扩增1)PCR反应体系ComponentVolume(μl)2×SGPCRMasterMix25DNA1ForwardPiemr(10μM)1ReversePrimer(10μM)1ddH2O22Total502)PCR反应程序3)1％agrosegel电泳，确定有特异扩增后，再扩增2个50μl体系的PCR，进行PCR产物回收。2、PCR产物回收1)加入4倍体积(800μl)的BufferCP到1.5ml离心管(含有PCR反应体积200μl)；2)剧烈震荡，短暂离心；3)把吸附柱放在收集管里；4)把步骤3的混合物转入吸附柱(每次750μl，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心)；5)13000g离心1min，弃滤液；6)加入700μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；7)加入500μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；8)13000g离心2min，甩吸附柱上的乙醇；9)把吸附柱转到一个新的1.5ml离心管，在吸附柱中心加入30μlddH2O，室温放置1min；13000g离心2min，滤液即是回收的DNA；10)PCR产物直接测序或连接T载体。3、PCR产物连接和转化1)按下表配制连接体系：ComponentVolume(μl)10×ReactionBuffer3PCRProduct10pTZ57R/T3T4DNALigase1ddH2O13Total302)轻轻摇匀，短暂离心；3)室温放置5min；4)连接产物直接转化；5)取出化学感受态细胞DH5α放于冰水混合物中解冻；6)加入连接产物，冰上放置30min；7)将管放于42℃水浴恰好90s，不可摇动；8)快速将管移到冰浴上2min，室温放置5min；9)每管加800μl没有抗生素的LB液体培养基，37℃振荡45min复苏；10)8000rpm离心1min，将上清液去掉800μl，重悬后均匀涂布到Amp抗性平板上；11)平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12-16h长出菌落；12)进行PCR菌落鉴定和测序。4、结果分析PCR扩增结果测序发现多浪羊Lin28B基因具有转录本1和转录本2；其中，转录本1的核苷酸序列为6630bp，包含1396bp的5'UTR，744bp的编码区和4490bp的3'UTR，具体如SEQIDNO：1所示；转录本2核苷酸序列为5271bp，包含13bp的5'UTR，768bp的编码区和4490bp的3'UTR，具体如SEQIDNO：2所示；利用TMHMM-2.0软件预测发现多浪羊Lin28a蛋白不是跨膜蛋白。实施例2本专利技术多浪羊的Lin28B基因在多浪羊下丘脑/垂体卵巢中的表达量。1、总RNA提取1)液氮研磨10-30mg左右样品后，转入一RNase-free1.5ml离心管里，加入1mlSGTRIzol裂解液；剧烈震荡，室温静置2-3min；2)加入200μl氯仿，剧烈涡旋30s，室温静置5min；3)4℃，12000×g离心15min；4)小心转移上清至一RNase-free1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇混匀；5)加入500μlRNAWashBufferI至柱子中，4℃，12000×g离心30s。弃滤液；6)13000×g，4℃离心10min；7)弃上清，加入1ml70％乙醇漂洗沉淀；8)13000×g，4℃离心5min；9)弃70％乙醇，空气晾干RNA；10)加60μlDEPC处理水溶解RNA；11)变性电泳检测，测定浓度，即可反转录使用或-80℃保存。2、DNaseI处理体系配置RNA5μg10×ReactionBufferwithMgCl21.2μlDNaseI2μlRibolock0.5μlDEPC处理水至12μl总体积12μl37℃水浴30min，65℃水浴10min灭活DNaseI。3、反转录mRNA反转录体系配置如下：DNaseI处理反应液12μlRandom1μl5×RTBuffer4μlM-MLVenzyme1μldNTP(10mM)2μl总体积20μl步骤如下：1)混匀，离心；2)37℃水浴60min；3)85℃水浴10min，灭活酶。4、Real-timePCR1)PCR体系配置(20μl体系)2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多浪羊的Lin28B基因，其特征在于，它是从多浪羊组织中克隆的、调控多浪羊初情期启动的Lin28B基因，它具有序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的两个核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.多浪羊的Lin28B基因，其特征在于，它是从多浪羊组织中克隆的、调控多浪羊初情期启动的Lin28B基因，它具有序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的两个核苷酸序列。2.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢凤，高庆华，祁鑫，李闯，李庆瑾，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65