海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。本发明专利技术通过扩增太平洋海洋杆菌R‑5321(Oceanobacillus picturae strain R‑5321)苹果酸脱氢酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于太平洋海洋杆菌属(Oceanobacillus picturae)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。有利于促进今后的太平洋海洋杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。

【技术实现步骤摘要】
海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种海洋低温苹果酸脱氢酶的启动子、终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。
技术介绍
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有强大的生物合成能力。海洋占据了地表的70％，蕴藏着丰富未知的海洋资源，是巨大的资源宝库。而海洋微生物更具有自身优势。其生产环境(高压、高盐、低温、低营养、低光照等)决定其产生的酶具有在低温和高盐环境下能够继续保持较高的活力。对海洋微生物低温酶的研究和开发，已经在国内外引起了广泛的关注。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其代谢产物的生产高效、快捷、具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。海洋微生物具有一种重要的生态功能-生物修复，作为海洋生态系统的重要组成，在海洋环境中，它们能够降解包括金属，石油产品，脂肪族和芳香族碳氢化合物，工业溶剂，农药及其它代谢物等化学物质。其中太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)便在其中扮演着重要的角色。在清除海洋环境污染物及海洋自净中发挥重要的作用。MDHs(低温苹果酸脱氢酶)作为生物体中心代谢途径的关键酶，在遗传变异和个体发育等具有重要的研究价值，并在临床诊断、工业检测具有广泛应用，市场需求量与日俱增，价值巨大。自上世纪50年代，就已经有学者从动物心肌中分离出MDHs。现阶段，市场上商业化的MDHs来源主要是猪、兔、牛的心肌、肝脏、骨骼肌中提取。原料成本低、来源广，但提取工艺繁琐，产品酶活较低。因此，拓展新的来源显得尤为重要。而海洋微生物是巨大的资源宝库。从中筛选新型的、低温的、高活性的目的MDHs产生菌株显得尤为重要。目前，未见适合于太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)的启动子序列的报道，也未见适用于太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)遗传操作系统，也未见高效的MDHs基因克隆载体，这些都制约了靶向性的菌株改造。因此，分离能够在太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)中启动报告基因表达的苹果酸脱氢酶启动子成为研究的热点。
技术实现思路
鉴于上述现有技术瓶颈，本专利技术的主要目的是提供可通用于太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)中外源基因表达的启动子和终止子的DNA表达盒。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：海洋低温苹果酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述海洋低温苹果酸脱氢酶启动子用于构建能够在太平洋海洋杆菌属(Oceanobacilluspicturaestrain)中表达的重组表达载体的应用，其中克隆了包含所述海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的重组表达载体的太平洋海洋杆菌属细菌菌株构成太平洋海洋杆菌细菌属遗传操作系统。一种DNA表达盒，其含有如SEQIDNO：1所示的海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的核苷酸序列。上述DNA表达盒，其还含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQIDNO：1所示的序列位于SEQIDNO：2所示的序列的上游，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架。上述DNA表达盒，所述编码目的基因的开发阅读框架的cDNA序列具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。上述DNA表达盒，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架，其序列之间为多克隆位点，并且包含选择性标记基因。上述启动子终止子来源如下：(A)一种具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：(1)具有如SEQIDNO：1所示序列的全部序列或包含3’-末端起1350bp以内的部分序列；(2)具有如SEQIDNO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1350bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，(3)或对SEQIDNO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQIDNO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。(B)一种来自太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子：具有如下：(1)具有如SEQIDNO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；(2)具有可与(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。(C)一种可完成靶基因在太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)中转录起始和转录终止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)转录启动子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，与其相邻1-1000个核苷酸的DNA片段。(D)本专利技术涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子；连接的DNA表达盒，以便于所述靶基因能够在太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspicturaestrain)中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。优选地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：为太平洋海洋杆菌属的细菌提供了启动子、终止子遗传转化方法，将有利于促进今后的太平洋海洋杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。附图说明图1表示MDH简并PCR产物(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；图2表示pMDH启动子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；图3表示MDHt终止子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。具体实施方式在专利技术中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如抗性基因)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因是否表达。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。在专利技术中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。本专利技术中的“太平洋海洋杆菌”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本专利技术中的启动子：(1)具有如SEQIDNO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1350bp以内的部分序列，(2)具有可与如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.海洋低温苹果酸脱氢酶启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.海洋低温苹果酸脱氢酶启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种含有权利要求1所述的海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的核苷酸序列的DNA表达盒。3.如权利要求2所述的DNA表达盒，其特征在于，所述表达盒还含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQIDNO：1所示的序列位于SEQIDNO：2所示的序列的上游，SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，肖景惠，王梦雨，迟乃玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21