一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，通过将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子、再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL‑12表达序列，得到HSV

【技术实现步骤摘要】
一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
本专利技术涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说是涉及一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。
技术介绍
溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。美国Amgen公司的Ⅰ型单纯疱疹重组病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验中显示出良好的肿瘤治疗效果，并成为首个获得美国FDA批准上市的溶瘤病毒类治疗药物。溶瘤病毒在黑色素瘤治疗上取得的成功引起了科学家对溶瘤病毒疗法更广泛的关注，溶瘤病毒的研究得到了进一步的推动。至今用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1，HSV-1)、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)和流感病毒等。溶瘤病毒按发展历程大致可分为4种类型：(1)野生型病毒株或自然减毒株，如新城疫病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒等；(2)基因工程选择性减毒株，主要是删除病毒某些关键基因而实现病毒复制的肿瘤选择性，如ONYX-015、G207等；(3)基因加载型病毒株，主要是在前述两种溶瘤病毒基础上加载外源治疗基因，如加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)的JX-594和T-VEC等；(4)转录靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入组织或肿瘤特异性启动子来控制溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制，如G92A等。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展、复发转移、放化疗抵抗的种子细胞，根除肿瘤干细胞有望治愈恶性肿瘤，包括已发生转移的恶性肿瘤病人。但是目前上市的溶瘤病毒中还没有能够选择性在肿瘤干细胞中繁殖的，实现只能选择性在肿瘤干细胞繁殖并杀灭肿瘤干细胞的目标，应用前景将非常广阔，由于转移性肿瘤中肿瘤干细胞占比高，因此该病毒对于转移性肿瘤尤为有效。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：本专利技术公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker1和Linker2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter；步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter；步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。上述技术方案中，步骤一中的ICP4启动子中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；下游序列ICP4-promoterUSr为AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；下游序列ICP4-promoterDSr为AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。上述技术方案中，步骤四中的ICP34.5基因中，上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5USf为CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；下游序列ICP34.5USr为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5DSf为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；下游序列ICP34.5DSr为TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。上述技术方案中，步骤一中，Linker1的引物序列为CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA；Linker2的引物序列为AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA。上述技术方案中，步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter通过四轮挑取嗜毒斑的方法进行纯化。本专利技术还公开了一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒，采用下述构建方法：将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成肿瘤干细胞特异性启动子，再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL-12表达序列构建得新型溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。上述技术方案中，所述肿瘤干细胞特异性启动子为ALDH1启动子。上述技术方案中，所述构建方法为一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4‑promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4‑promoter；步骤二、构建pdICP4‑ALDH1‑promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1‑ALDH1‑promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4‑promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4‑ALDH1‑promoter；步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4‑ALDH1‑promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17‑d4‑ALDH1‑promoter；步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；步骤五、构建质粒pdICP34.5‑hIL‑12：用hIL‑12基因替代质粒pcDNA3.1‑ALDH1‑promoter中的ALDH1‑promoter，产生质粒pcDNA3.1‑hIL‑12；把来自质粒pcDNA3.1‑hIL‑12中的hIL‑12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5‑hIL‑12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5‑hIL‑12用来删除步骤三中重组病毒载体17‑d4‑ALDH1‑promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL‑12。...

【技术特征摘要】
1.一种选择性杀灭肿瘤干细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker1和Linker2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；步骤二、构建pdICP4-ALDH1-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人ALDH1启动子序列从质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-ALDH1-promoter；步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-ALDH1-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达ALDH1启动子的重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter；步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-ALDH1-promoter中的ALDH1-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-ALDH1-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVALDH1+IL-12。2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭肿瘤干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁志丰，刘复兴，吴基良，武倩，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42