重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组融合细胞因子IL‑7‑Linker‑IL‑15腺病毒的构建方法，首先构建pDC316‑IL‑7‑Linker载体，然后将IL‑15片段通过基因克隆的方法连到pDC316‑IL‑7‑Linker上，构建pDC316‑IL‑7‑Linker‑IL‑15；最后将pDC316‑IL‑7‑Linker‑IL‑15和骨架载体pBHGlox△E1、3Cre共转染HEK293细胞进行包装，得到表达融合细胞因子IL‑7‑Linker‑IL‑15的腺病毒。重组IL‑7‑Linker‑IL‑15腺病毒作为佐剂应用在结核亚单位疫苗中，调控疫苗免疫后记忆性T细胞的分化，增强了疫苗诱导的中央记忆性T细胞介导的免疫应答，提高了结核亚单位疫苗的免疫保护作用。

【技术实现步骤摘要】
重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒及其构建和应用
本专利技术具体涉及一种重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建；本专利技术同时还涉及该融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15作为细胞免疫佐剂在结核亚单位疫苗中的应用策略，属于疫苗制造

技术介绍
结核病（tuberculosis）是一种主要由结核分枝杆菌感染（Mycobacteriatuberculosis）引起的慢性传染性疾病。其病死率在传染性疾病中已经居于第一位，是全世界的第九大死因。预防和控制传染病的最佳方式就是有效疫苗的接种，结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。目前唯一临床批准的预防结核病的疫苗是牛分枝杆菌减毒活疫苗卡介苗（BacilleCalmette-Guérin，BCG）。它可以有效控制儿童严重结核病的发生，但是对成人肺结核的保护效果不确定，保护性免疫应答随着年龄的增加逐渐减弱。研究报道，主要是因为BCG的持续刺激，诱导更多的寿命较短的效应记忆性T细胞和效应T细胞产生，而提供长效免疫保护效果的中央记忆性T细胞较少所致。蛋白亚单位疫苗是一种新型的结核疫苗，它需要佐剂的辅助诱导较强的免疫应答，合适的佐剂能提高免疫应答的水平。目前临床上获批的佐剂很少，它们主要促进体液免疫应答。因此，研发新的可诱导T细胞免疫应答的佐剂，提高中央记忆T细胞的数量、增强长效的保护效果是目前的当务之急。一些研究表明：IL-7和IL-15对于记忆T细胞的发育和维持至关重要，具有促进免疫记忆的作用。IL-7和IL-15活化不同的受体及信号通路调控淋巴细胞的发育分化。我们将IL-7和IL-15进行融合构建一种融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15，设想他们同时作用于IL-7R和IL-15R激活相关信号分子，作为佐剂应用在结核亚单位疫苗中，调控疫苗免疫后免疫记忆性T细胞的分化，增强中央记忆性T细胞的分化和维持较为长久的免疫记忆，增强结核亚单位疫苗的免疫保护作用。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种由IL-7和IL-15进行融合构建的重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15的腺病毒；本专利技术的另一目的，是提供一种上述重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建方法；本专利技术还有一个目的，就是提供上述重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒作为佐剂在结核亚单位疫苗中的应用，分析重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15的佐剂效应。一、重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建、包装本专利技术重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建，是先构建pDC316-IL-7-Linker载体，Linker为(GGGS)3；然后PCR扩增IL-15基因片段，将IL-15基因片段通过限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法连接到pDC316-IL-7-Linker中，构建成pDC316-IL-7-Linker-IL-15；最后将pDC316-IL-7-Linker-IL-15和骨架载体pBHGlox△E1、3Cre转染HEK293细胞并进行包装，通过验证并将包装成功的腺病毒进行扩增，得到克隆了融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15基因的腺病毒。具体步骤如下：（1）构建重组载体pDC316-IL-7-Linker：以pUC57-IL-7-Linker质粒为载体，采用上游、下游两条引物，PCR扩增出IL-7-Linker基因产物；该PCR产物经纯化后，用BglII和HindIII进行双酶切，克隆构建在质粒pDC316上，构建成pDC316-IL-7-Linker载体；所述上游引物为：5’-3’GAAGATCTATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGG，其中斜体为BglII限制性酶切位点；下游引物为5’-3’TAGGCAAGCTTACTTGGTGGTGGCGATGGTGGTGGACTT，其中斜体为HindIII限制性酶切位点；（2）构建重组载体pDC316-IL-7-Linker-IL-15：以pUC57-IL-15质粒为载体，采用上游、下游两条引物，PCR扩增出IL-15基因产物；该PCR产物经纯化后，用HindIII和SalI进行双酶切，克隆构建在质粒pDC316-IL-7-Linker上，构建成pDC316-IL-7-Linker-IL-15载体。所述上游引物为：5’-3’CCCAAGCTTATGAAAATTTTGAAACCATATATGAGGAATAC，其中斜体为HindIII限制性酶切位点；下游引物为5’-3’ACGCGTCGACTCAGGACGTGTTGATGAACATTT，其中斜体为SalI限制性酶切位点。（3）pDC316-IL-7-Linker-IL-15质粒载体的包装：将pDC316-IL-7-Linker-IL-15和骨架载体pBHGlox△E1、3Cre转染HEK293细胞并进行包装，即得到重组了融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15基因的腺病毒。该腺病毒感染宿主细胞表达融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15。融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15，其基因序列如下：。二、重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的应用下面通过动物实验对本专利技术构建的重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒作为佐剂在结核亚单位疫苗中的应用效果进行说明。1.实验动物及分组6-8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠。实验动物分组：LT70（结核融合蛋白抗原ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626）+MH（结核融合蛋白抗原MTB0.4-HSPX）组、LT70+MH+rAd-Vector组、LT70+MH+rAd-IL-7组、LT70+MH+rAd-IL-15组、LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15组、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15组和LT70+MH+rAd-IL-7-Linker-IL-15组。2.免疫用亚单位疫苗LT70+MH的配制1）将LT70和MH分别用PBS稀释到0.2mg/ml；2）PolyI:C用PBS缓冲液溶解至1mg/ml；3）将DDA用PBS配制成2.5mg/ml；80℃水浴10min，冷却至室温；4）加50μlPolyI:C溶液与等量LT70+MH（5µgLT70和5µgMH）溶液充分混匀，室温放置1min。随后逐滴加入100µL的DDA，使其充分乳化即得到亚单位疫苗LT70+MH-DDA/PolyI:C。该疫苗免疫用量为200µl/小鼠。3.免疫接种方案亚单位疫苗和重组腺病毒均在第0、2、4周免疫小鼠，其中亚单位疫苗于腹股沟皮下注射，重组腺病毒通过腹腔注射。其中LT70+MH疫苗（5µgLT70、5µgMH、250µgDDA和50µgPolyI:C）的注射剂量为200µl/小鼠。重组腺病毒的注射体积为100µl/小鼠（含有病毒5×106PFU），在接种疫苗LT70+MH30min后腹腔注射重组腺病毒。4.免疫指标的检测方法主要包括延长ELISPO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组融合细胞因子IL‑7‑Linker‑IL‑15腺病毒，其特征在于：重组融合细胞因子IL‑7‑Linker‑IL‑15的基因序列如下：

【技术特征摘要】
1.重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒，其特征在于：重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15的基因序列如下：。2.如权利要求1所述一种重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建方法，首先构建了pDC316-IL-7-Linker载体；然后PCR扩增IL-15基因片段，将IL-15基因片段通过限制性内切酶酶切和连接酶连接的方法连接到pDC316-IL-7-Linker中，构建成pDC316-IL-7-Linker-IL-15；最后将pDC316-IL-7-Linker-IL-15和骨架载体pBHGlox△E1、3Cre转染HEK293细胞并进行包装，通过验证并将包装成功，得到重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15的腺病毒；其中Linker为(GGGS)3。3.如权利要求2所述一种重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建方法，其特征在于：pDC316-IL-7-Linker的载体构建，是以pUC57-IL-7-Linker质粒为载体，采用上游、下游两条引物，PCR扩增出IL-7-Linker基因产物；该PCR产物经纯化后，用BglII和HindIII进行双酶切，克隆构建在质粒pDC316上，构建成pDC316-IL-7-Linker载体。4.如权利要求3所述一种重组融合细胞因子IL-7-Linker-IL-15腺病毒的构建方法，其特征在于：所述上游引物为：5’-3’GAAGATCTATGTTCCATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝秉东，白春香，何娟娟，吕薇，唐君霞，周利军，韩江媛，牛红霞，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62