一种表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒制造技术

本发明专利技术提供了一种表达H5N1亚型HA的复制缺陷重组H9N2禽流感病毒，本重组禽流感病毒株作为疫苗同时提供对H5N1亚型和H9N2亚型禽流感的保护，复制缺陷的特性又提高了弱毒疫苗的安全性。本发明专利技术的原理是基于没有改变遗传稳定性的前体下，构建的重组流感病毒可同时稳定表达禽流感病毒H9N2和H5N1亚型的表面糖蛋白血凝素HA，但只有在可稳定表达神经氨酸酶H9N2亚型NA的MDCK细胞中，构建的重组病毒才能复制、成功包装出重组病毒粒子，由于缺乏结构蛋白神经氨酸酶NA基因，构建的重组病毒在实验动物体内不能复制，对机体没有致病性，但是能诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平。

A replication-deficient recombinant H9N2 avian influenza virus expressing H5 subtype HA

The invention provides a replication defect recombinant H9N2 avian influenza virus expressing H5N1 subtype HA. The recombinant avian influenza virus strain serves as a vaccine and provides protection for H5N1 subtype and H9N2 subtype avian influenza. The characteristics of replication defect also improve the safety of attenuated vaccine. The principle of the present invention is that the recombinant influenza virus can stably express the surface glycoprotein haemagglutinin HA of avian influenza virus H9N2 and H5N1 subtypes simultaneously without changing the genetic stability of the precursors, but only in MDCK cells stably expressing the neuraminidase H9N2 subtype NA, the recombinant virus can replicate and successfully package the recombinant virus particles, due to the lack of structured eggs. The recombinant virus constructed by the NA gene of albumin neuraminidase can not replicate in experimental animals and has no pathogenicity to the organism, but it can induce strong mucosal and cellular immune responses.

【技术实现步骤摘要】
一种表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒
本专利技术属于流感病毒疫苗技术研发领域，具体涉及一种表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒；即一种可同时表达A型流感病毒H9N2和H5N1两种亚型的表面蛋白血凝素HA的重组流感病毒，及其制备方法和应用。
技术介绍
禽流感是由A型流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的禽类呼吸系统疾病和全身败血症的一类传染病。H5N1亚型禽流感病毒是一种高致病性病毒，极具传染性，严重危害禽类、人类以及其他动物。H9N2亚型是一种低致病性禽流感病毒，其广泛存在于世界范围内，危害持久并难以控制，特别是混合感染导致较高的死亡率。同时H9N2亚型流感病毒还是H5N1、H7N9等亚型流感病毒的内部基因供体，可形成新的重组病毒，严重危害我国养禽业的发展和公共卫生健康。因此，对于H9N2和H5N1亚型流感病毒的研究与防治不容忽视。目前，疫苗免疫仍是防控禽流感最重要和最有效的措施，针对H5N1亚型和H9N2亚型禽流感病毒已经批准使用的只有灭活苗，也没有可同时保护H9N2和H5N1亚型禽流感病毒的弱毒活疫苗，并且传统的流感病毒弱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法如下：1)在H9N2病毒的神经氨酸酶NA的5′端的包装信号区和3′端的包装信号区内插入H5N1亚型的血凝素HA基因的开放阅读框，形成用于合成A型流感病毒NA‑HA的DNA片段；2)将1)中构建的用于合成A型流感病毒NA‑HA的DNA片段克隆到质粒上形成重组质粒；3)构建表达H9N2流感病毒神经氨酸酶NA基因的MDCK细胞系；4)将2)中构建的重组质粒，与表达H9N2的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS各个基因片段的重组质粒共同转染到293T细胞和可稳定表达H9N2流感病毒神经氨酸酶NA基因的MD...

【技术特征摘要】
1.一种制备表达H5亚型HA的复制缺陷型重组H9N2禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法如下：1)在H9N2病毒的神经氨酸酶NA的5′端的包装信号区和3′端的包装信号区内插入H5N1亚型的血凝素HA基因的开放阅读框，形成用于合成A型流感病毒NA-HA的DNA片段；2)将1)中构建的用于合成A型流感病毒NA-HA的DNA片段克隆到质粒上形成重组质粒；3)构建表达H9N2流感病毒神经氨酸酶NA基因的MDCK细胞系；4)将2)中构建的重组质粒，与表达H9N2的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS各个基因片段的重组质粒共同转染到293T细胞和可稳定表达H9N2流感病毒神经氨酸酶NA基因的MDCK细胞系中，并收集转染后293T细胞和表达NA的MDCK细胞的上清培养液；5)在稳定表达H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶NA的MDCK细胞系上扩增4)中拯救出的重组流感病毒。2.如权利要求1所述的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军伟，孙明宏，吴叔文，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37