一种同时表达HA和HEF的复制缺陷型重组流感病毒制造技术

本发明专利技术提供一种复制缺陷型A、D二价流感病毒弱毒活疫苗制备方法。本发明专利技术构建了一种重组病毒株，在没有改变基因稳定性前体下，构建的重组病毒可稳定的同时表达A型流感病毒H1N1亚型的表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一的表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF。所构建的弱毒株不仅具有良好的基因稳定性而且在实验动物体内不能复制，所以并不具备致病性，同时还可诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平，保持强烈且持久的免疫原性。最关键的是，该疫苗侯选株可对A型流感病毒H1N1亚型和D型流感病毒均可产生免疫保护作用。那么对于A型和D型流感的预防与控制具有巨大的社会意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同时表达HA和HEF的复制缺陷型重组流感病毒
本专利技术属于流感病毒疫苗技术研发领域，具体涉及一种可同时表达A型流感病毒H1N1表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF的重组流感病毒的制备方法及用途。
技术介绍
流感是由流感病毒(InfluenzaVirus)引起的严重危害人和动物呼吸道系统的传染病。跟据其核蛋白抗原性不同将流感病毒分为A、B、C三型(IAV、IBV、ICV)，感染人的流感病毒主要是A型和B型。D型流感病毒(IDV)是近年来发现的一种新型流感病毒，感染人和哺乳动物。目前流感疫苗是预防和控制流感病毒流行的主要方法，常用的流感疫苗有灭活苗和弱毒苗：灭活苗存在问题主要是抗原性差，只能诱导抗体免疫；弱毒流感疫苗是低温适应流感病毒株，能同时诱导较强的抗体免疫应答和细胞免疫应答反应，但是目前批准的弱毒流感疫苗毒株只能表达一个亚型的HA，并且低温适应毒株研发的周期长，还有潜在的毒力回复突变的潜在危险；而且目前还没有针对D型流感病毒的疫苗。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：研究开发一种复制缺陷型A、D二价流感病毒弱毒活疫苗制备方法。本专利技术首先提供一种复制缺陷型重组流感病毒的制备方法，所述方法包括如下的步骤：1)合成包含有D型流感病毒表面糖蛋白-血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框、A型H1N1流感病毒NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的DNA片段，将合成的DNA片段插入到载体质粒pHW2000上，构建成重组质粒pHW-NA-HEF；其中DNA片段，其一种具体的序列为SEQIDNO:1；2)将步骤1)构建的重组质粒pHW-NA-HEF与用于表达A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS基因的重组质粒共同转染293T细胞和稳定表达流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞；所述的NA基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：2；3)收集转染后293T细胞和MDCK细胞的上清培养液；4)在稳定表达A型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA基因的MDCK细胞系上拯救并扩增重组流感病毒；本专利技术另一个方面提供一种重组病毒株，该病毒株是用上述方法构建的；构建的重组病毒株能够用来制备疫苗；所述的疫苗，为弱毒活疫苗。本专利技术构建了一种重组病毒株，在没有改变基因稳定性前体下，构建的重组病毒可稳定的同时表达A型流感病毒H1N1亚型的表面蛋白血凝素HA和D型流感病毒唯一的表面蛋白血凝素酯酶融合蛋白HEF。所构建的弱毒株不仅具有良好的基因稳定性而且在实验动物体内不能复制，所以并不具备致病性，同时还可诱导机体产生很强的粘膜免疫应答和细胞免疫应答水平，保持强烈且持久的免疫原性。最关键的是，该疫苗侯选株可对A型流感病毒H1N1亚型和D型流感病毒均可产生免疫保护作用。那么对于A型和D型流感的预防与控制具有巨大的社会意义。附图说明图1：本专利技术实施的技术路线图；其中a)为D型流感病毒表面蛋白HEF的开放阅读框插入到H1N1神经氨酸酶NA开放阅读框位置，并保留NA两端的非编码区的模拟图b)流感病毒H1N1亚型的8个基因片段模拟图图2：A/Califronia/2009/07H1N1流感病毒神经氨酸酶NA的凝胶电泳图。图3：合成NA-HEF的DNA序列凝胶电泳图。图4：CA09-HEF病毒生长曲线图。图5：不同浓度重组CA09-HEF病毒液攻毒后实验动物体重变化。图6：不同浓度重组CA09-HEF病毒液攻毒后实验动物存活率。图7：免疫接种重组CA09-HEF病毒液后实验动物体重变化。图8：免疫接种重组CA09-HEF病毒液后实验动物存活率。具体实施方式本专利技术构建了可同时表达A型流感病毒H1N1表面糖蛋白血凝素HA和D型流感病毒表面糖蛋白HEF的复制缺陷型二价流感病毒弱毒株，可作为疫苗侯选株。本专利技术所构建的重组病毒只能在表达流感病毒NA的稳定细胞系上复制，从而大大提高了本病毒作为弱毒疫苗的安全性。为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍：实施例11、将A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS的RNA片段体外反转录制成cDNA，以cDNA为模板扩增流感病毒的基因片段，分别克隆到表达载体质粒pHW2000上。即得7个质粒分别为pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-M、pHW-NS。2、构建质粒pHW-NA-HEF新构建质粒pHW-NA-HEF(图1)：首先合成DNA序列NA-HEF(Genscript公司)，该序列保留了A型流感病毒H1N1NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的包装信号。利用PCR技术进行目的片段NA(202nt)-ORF(HEF)-NA(185nt)的扩增(如图2)。上游引物序列：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT、下游引物序列：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；新合成的目的片段NA(202nt)-ORF(HEF)-NA(185nt)的DNA序列为SEQIDNO:1；分别用BsmB1和Bsa1酶切质粒pHW2000和PCR回收产物NA-HEF；利用T4DNAligase连接以上两个酶切片段的回收产物，即构成质粒pHW-NA-HEF。实施例2拯救重组病毒构建细胞系：构建可稳定表达A/Califronia/2009/07(H1N1)流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶NA的MDCK细胞系。具体步骤如下：G418筛选稳定表达细胞系：筛选前，确定G418筛选MDCK细胞的最佳浓度为500μg/mL。G418的配制：取1gG418溶于1mL1M的HEPES溶液中，加超纯水至10mL，过滤，4℃保存备用。(1)将A型流感病毒亚型H1N1表面糖蛋白神经氨酸酶NA的RNA片段体外反转录制成cDNA，以cDNA为模板扩增流感病毒的NA基因片段，并克隆到载体质粒pD2EGFP-N1上。即得质粒pD2EGFP-NA。(2)将MDCK细胞铺于6孔板，培养在含有10％胎牛血清的(FetalBovineSerum，FBS)和1％双抗(Penicillin-StreptomycinSolution，PS)的MEM培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自BiologicalIndustries公司)。待细胞生长密度达到60-70％左右进行转染。(3)细胞转染前将6孔细胞培养板中的培养液吸弃掉，用PBS洗两遍，更换为新鲜的opti-MEM培养液，培养板放回培养箱。(4)配制转染试剂：SolutionA：向一个无菌的1.5mL离心管中加入100μL的opti-MEM培养液，再加入2μg质粒pD2EGFP-NA，轻轻混匀，室温静置5分钟。SolutionB：向一个无菌的1.5mL离心管中加入100μL的opti-MEM培养液，再加入6-8μLLipofectamine2000(Invitrogen公司)转染试剂。然后将solutionA缓慢的加入到solutionB中，室温静置20分钟。(5)取出6孔板，将(4)中的混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制缺陷型重组流感病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：1)合成包含有D型流感病毒表面糖蛋白‑血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框、A型H1N1流感病毒NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的DNA片段，将合成的DNA片段连接到载体质粒pHW2000上，构建成重组质粒pHW‑NA‑HEF；2)将步骤1)构建的重组质粒pHW‑NA‑HEF与用于表达A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS七个基因序列的质粒共同转染到293T细胞和稳定表达流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞。；3)收集转染后293T细胞和改造后MDCK细胞的上清培养液；4)在稳定表达A型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞系上扩增拯救出的重组流感病毒CA09‑HEF。

【技术特征摘要】
1.一种复制缺陷型重组流感病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：1)合成包含有D型流感病毒表面糖蛋白-血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框、A型H1N1流感病毒NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的DNA片段，将合成的DNA片段连接到载体质粒pHW2000上，构建成重组质粒pHW-NA-HEF；2)将步骤1)构建的重组质粒pHW-NA-HEF与用于表达A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS七个基因序列的质粒共同转染到293T细胞和稳定表达流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞。；3)收集转染后293T细胞和改造后MDCK细胞的上清培养液；4)在稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军伟，孙明宏，刘博，单虎，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37