马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗技术

本发明专利技术提供了一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域。该融合蛋白将马流感病毒H3N8亚型HA基因和NA基因序列进行串联，表达的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。该融合蛋白可应用于制备疫苗、抗体和用于检测马流感病毒的试剂盒。包含该融合蛋白的疫苗具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。

【技术实现步骤摘要】
马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
技术介绍
马流行性感冒(EquineInfluenza，EI)是由马流感病毒(EquineInfluenzaVirus，EIV)引起的一种急性传染病，它具有急性、高度接触传染性的特点。H3N8亚型是主要流行株，是马呼吸道传染病之一。马流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、A型流感病毒属。是一种分节段的大小不等的单股负链RNA有囊膜的病毒，基因组长约13.6kb。病毒粒子形态很多，大多数呈球形状，其直径约为80-120nm，丝状体能长达数微米。病毒粒子结构主要分为三层，最外层的囊膜是由双层类脂质所构成，两种形态不同的重要蛋白突起在囊膜里镶嵌着，一种像蘑菇样的是神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，另一种像棒状的结构是血凝素(Hemagglutinin，HA)，囊膜上NA与HA的比例大约为5:1-4:1。中间层是基质蛋白(M1)形成的球形蛋白壳，还有少量的离子通道蛋白(Ionchannelprotein)在双层类脂膜上，称为M2蛋白。马流行性感冒一年四季均可发生，传播极为迅速，多呈暴发流行。染马流感病毒后，传播速度非常快，伴有发热、精神抑郁，结膜潮红，咳嗽和流浆性鼻液、呼吸困难，食欲大减，并且多因继发感染而引起病情加重或死亡、怀孕母马可能发生流产、赛马丧失竞技能力。流感的主要传染源是病马与带毒马，各个年龄和各个品种的马都有发生的可能性，春夏秋冬都会发生，患病率可以达到100％，给养马业造成较大经济损失。目前国内尚无预防马流感的亚单位疫苗。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，该融合蛋白将马流感病毒H3N8亚型的HA蛋白和NA蛋白进行串联表达。本专利技术的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该制备方可以表达出上述融合蛋白。本专利技术的第三目的在于提供一种上述融合蛋白或上述制备方法制备得到的蛋白的应用，可应用于制备疫苗、抗体和病毒检测等多个方面。本专利技术的第四目的在于提供一种包含上述融合蛋白的疫苗，该疫苗免疫原性好，保护效力高。为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，包括HA区段和NA区段；所述HA区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述NA区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。优选地，HA区段和NA区段的排列顺序为HA-NA，通过Linker连接；优选地，所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。优选地，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种上述融合蛋白的制备方法，该制备方法通过将所述融合蛋白的基因在宿主中表达；优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述融合蛋白的基因；优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述融合蛋白的基因。优选地，提供包含表达所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述融合蛋白。优选地，使用谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统筛选表达所述融合蛋白的CHO细胞株；优选地，所述谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统中使用的表达载体为pcDNA3、pEE6.4或pEE12.4。优选地，采用逐渐驯化的方法传代至少6代获得悬浮培养的表达所述融合蛋白的CHO细胞株。本专利技术还提供了一种上述融合蛋白或上述制备方法制备得到的蛋白的应用，包括如下(a)-(d)中的至少一种：(a)制备马流感病毒疫苗；(b)制备马流感病毒的抗体；(c)制备检测马流感病毒抗体的试剂盒；(d)制备马流感病毒诊断抗原。本专利技术还提供了一种包含上述融合蛋白的马禽流感H3N8亚型的疫苗。优选地，所述疫苗中所述融合蛋白的浓度为20-100μg/ml，优选30-80μg/ml，更优选50μg/ml；优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或ISA201VG，优选使用ISA201VG。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，将马流感病毒H3N8亚型HA基因和NA基因序列进行串联，本专利技术通过对HA基因和NA基因进行分析，选取了抗原性好，易高表达的区域进行串联，得到的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。本专利技术提供的上述融合蛋白的制备方法，通过将上述融合蛋白的基因在宿主中表达即可。本专利技术提供的上述融合蛋白和上述制备方法制备得到的蛋白的应用范围十分广泛，可以用以制备马流感病毒疫苗和马流感病毒的抗体。马流感病毒的抗体和上述融合蛋白可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，以用于检测马流感病毒抗体，例如使用含有马流感病毒的抗体的ELISA试剂盒以检测马流感病毒，或者使用含有该融合蛋白的胶体金免疫层析试纸检测待测血清样品中的马流感病毒抗体含量。本专利技术提供的包含上述融合蛋白的疫苗，具有较好的免疫原性，免疫动物后可以产生较高滴度的抗体滴度，使动物获得较好的保护效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例2提供的PEE6.4-HA-NA质粒图谱；图2为本专利技术实施例2提供的酶切鉴定结果；图3为本专利技术实施例6提供的细胞表达蛋白的Werstern-Blotting检测；图4为本专利技术实施例8提供的免疫马流感病毒HA-NA亚单位疫苗后BALB/c小鼠抗体水平变化。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提供了一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，该融合蛋白是马流感病毒融合蛋白，该融合蛋白包括HA区段和NA区段；所述HA区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述NA区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。血凝素(hemagglutinin，HA)是马流感病毒的主要表面抗原，负责病毒粒子、宿主细胞的连接，HA基因核苷酸长度为1742-1778个碱基，只有一个编码框，编码含562-566个氨基酸的蛋白肽，大小为70KD，其羧基在囊膜内，氨基端在囊膜外，为典型的Ⅰ型糖蛋白。神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是马流感病毒另一个主要表面抗原，其成分为整体膜糖蛋白，含一个开放阅读框，有1443-1492个核苷酸，编码约459个氨基酸，有3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，其特征在于，包括HA区段和NA区段；所述HA区段主要由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述NA区段主要由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

【技术特征摘要】
1.一种马流感病毒H3N8亚型的融合蛋白，其特征在于，包括HA区段和NA区段；所述HA区段主要由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述NA区段主要由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，HA区段和NA区段的排列顺序为HA-NA，通过Linker连接；优选地，所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。4.一种权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，将所述融合蛋白的基因在宿主中表达；优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述融合蛋白的基因；优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述融合蛋白的基因。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提供包含表达所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行加压筛选，再将加压筛选出的CHO细胞驯化成悬浮培养的细胞株，使所述悬浮培养的细胞株表达所述融合蛋白。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，使用谷氨酰胺合...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，任立松，李延涛，陈泽良，任郭子君，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65