猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。本发明专利技术提供的猪伪狂犬病毒的融合蛋白包括gB区段和gD区段，gB区段由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为选用经典毒株和当前流行毒株的基因作为研究对象，通过对比分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。本发明专利技术还提供了融合蛋白的制备方法及应用和制备的疫苗。

Fusion protein of porcine pseudorabies virus and preparation method, application and vaccine thereof

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a fusion protein of porcine pseudorabies virus and a preparation method, application and vaccine thereof. The fusion protein of the swine pseudorabies virus includes the gB segment and the gD segment, and the gB segment is expressed by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1, and the gD segment is expressed by the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO.2. Sequences shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 are selected from classical strains and currently prevalent strains as research objects. The sequences obtained by comparative analysis are optimized and modified by codons to further improve the broad spectrum of fusion protein antigen and the expression of antigen. The invention also provides a preparation method of fusion protein, application and vaccine prepared.

【技术实现步骤摘要】
猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
技术介绍
猪伪狂犬病(porcinepseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesbvirus，PRV)引起的、严重危害我国养猪业健康发展的重要传染病之一。该病毒属于疱疹毒科甲型疱疹病毒亚科的线性双链DNA病毒，病毒DNA的G+C含量相对较高。目前已知病毒糖蛋白有11种，即必需糖蛋白和非必需糖蛋白。伪狂犬病的易感范围很广，新生仔猪多为致死性感染，和其他易感物种相类似，多死于中枢神经系统疾病。成年猪感染该病多表现呼吸系统疾病，大多呈隐性感染，无明显症状。猪感染PRV后，自身的免疫系统受到损害，免疫力下降，因而更易继发其他疾病，例如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等。给猪伪狂犬病的防治增加了难度。目前，PR的感染和发病率都很高，极易造成巨大的经济损失。对于2周龄以内的哺乳仔猪来说，在感染初期可能会出现发热、厌食、呕吐、下痢、精神不振等症状；随着病情的加深继而出现神经临诊症状，如发抖、共济失调、倒地四肢划动；常伴有癫痫样发作或肌肉抽搐，昏睡，最后衰竭死亡；死亡率可高达100％。稍大一些的约3-4周龄的猪主要临诊症状同于2周龄仔猪，但是比2周龄仔猪的病程稍长，伴有便秘现象，死亡率一般可达40-60％；即使耐过，也会伴发有生长发育迟缓、受阻、偏瘫等后遗症。2月龄以上的猪自身免疫力增强，感染PRV后多呈隐性感染，无明显的临床症状；有症状也较轻微，一过性的发热和咳嗽，也可能会有呕吐现象。怀孕母猪对PRV易感性较高，感染后表现为咳嗽、精神沉郁、食欲减退等呼吸系统、消化系统症状，继而出现流产症状、产木乃伊胎、产死胎和产弱仔，其中以死胎为主。所产的弱仔猪常伴有腹泻、痉挛、运动失调、角弓反张等症状，通常在24-36h内死亡。对猪伪狂犬病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合伪狂犬病毒gE抗原和gE抗体检测淘汰、净化野毒感染猪。目前，国内外临床应用的PR疫苗大体可分为以下三类：一是将分离的野毒或强毒经甲醛灭活后，加佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗；二是将分离的野毒或强毒经非猪源细胞或者鸡胚反复传代致弱研制的弱毒疫苗；三是利用基因工程技术构建的基因缺失疫苗。灭活疫苗虽然安全，但免疫效力有限，又不能起到疫病净化的目标。弱毒疫苗安全性存在隐患，生产周期长，成本高。此外，猪伪狂犬病毒用基因缺失活疫苗、全病毒灭活疫苗均在贴壁细胞上生长，且需要动物源蛋白，为疫苗制造带来风险。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，该融合蛋白广谱性好，具有良好的免疫原性，制备得到的抗体滴度高并且可以预防多种亚型的猪伪狂犬病毒。本专利技术的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白。本专利技术的第三目的在于提供上述融合蛋白的应用。本专利技术的第四目的在于提供一种包含上述融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，包括gB区段和gD区段；所述gB区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述gD区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。进一步地，所述gB区段和所述gD区段的排列顺序为gB-gD，通过Linker连接；所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。进一步地，所述融合蛋白为HEK293-F细胞表达系统表达的蛋白。一种上述融合蛋白的制备方法，在哺乳动物表达系统中，表达编码所述融合蛋白的基因。进一步地，在HEK293-F细胞表达系统中表达编码所述融合蛋白的基因。进一步地，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入HEK293-F细胞中，然后对HEK293-F细胞进行筛选，得到稳定表达所述融合蛋白的HEK293-F细胞株，所述HEK293-F细胞株表达得到所述融合蛋白；优选地，所述筛选包括加压筛选和单克隆筛选。进一步地，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述融合蛋白的HEK293-F细胞；优选地，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13，优选为pcDNA3.1。上述融合蛋白或制备方法制备得到的融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：A)制备猪伪狂犬病毒疫苗；B)制备猪伪狂犬病毒的抗体；C)制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒；D)制备猪伪狂犬病毒诊断抗原。一种包含上述猪伪狂犬病毒的融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。进一步地，所述猪伪狂犬病毒疫苗中融合蛋白的用量为70-90μg/头份；优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的猪伪狂犬病毒的融合蛋白包括gB区段和gD区段，gB区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列为选用经典毒株和当前流行毒株的基因作为研究对象，通过对比分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。该融合蛋白的广谱性好，具有良好的免疫原性，制备得到的抗体滴度高并且可以预防多种亚型的猪伪狂犬病毒。本专利技术提供上述融合蛋白的制备方法，该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白，并且操作简单，适合规模化生产。本专利技术提供包含上述融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗，制备成本低，不到现有疫苗生产成本的1％，同时免疫效果好。用该疫苗免疫21日龄的仔猪后，免疫21日后分别采血测中和抗体，结果显示21日中和抗体不低于1:1000，并且，攻毒结果显示该疫苗既能够有效预防经典强毒(SC株)和当前流行毒株的攻击(JS株)，保护率可以达到100％。该疫苗优于常规疫苗。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1中gB基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：MarkerDL15000、gB基因PCR扩增产物；图2为本专利技术实施例2中gD基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：MarkerDL15000、gD基因PCR扩增产物。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，包括gB区段和gD区段，其中，gB区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。gB蛋白作为PRV囊膜构成的主要组成成分，也是PRV重要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，其特征在于，包括gB区段和gD区段；所述gB区段由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，其特征在于，包括gB区段和gD区段；所述gB区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述gD区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述gB区段和所述gD区段的排列顺序为gB-gD，通过Linker连接；所述Linker具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为HEK293-F细胞表达系统表达的蛋白。4.权利要求1-3任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，在哺乳动物表达系统中，表达编码所述融合蛋白的基因。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在HEK293-F细胞表达系统中表达编码所述融合蛋白的基因。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入HEK293-F细胞中，然后对HEK293-F细胞进行筛选，得到稳定表达所述融合蛋白的HEK293-F细胞株，所述HEK293-F细胞株表达得到所述融合蛋白；优选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，李俊辉，师小潇，张伟，潘晓梅，石丁锋，程兰玲，王遵宝，豆智华，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65