融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗技术方案

本发明专利技术提供了一种融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗，涉及生物技术领域，本发明专利技术提供的融合蛋白，包括假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分。本发明专利技术通过筛选出PCV2和PCV3 Cap蛋白的优势抗原表位，其抗原性好，易高表达，然后将各优势表位与PEA部分功能性片段融合，同时在融合蛋白C端加入了羧基末端序列以及增强免疫原性，增加了融合蛋白的可溶性。得到的融合蛋白具有靶向定位，抗原性好，表达量高的优点。将该融合蛋白作为抗原制备疫苗具有安全性好，效价稳定，无毒副作用，激活细胞免疫应答的优势。

Fusion protein and its preparation, application, expression system and vaccine

The invention provides a fusion protein and its preparation method, application, expression system and vaccine, and relates to the biotechnology field. The fusion protein provided by the invention includes * * Pseudomonas exotoxin A domain segment, porcine circovirus type 2 Cap protein dominant epitope region, porcine circovirus type 3 Cap protein dominant antigen epitope region and carboxyl terminal part. By screening out the dominant antigenic epitopes of PCV2 and PCV3 Cap proteins, the method has good antigenicity and is easy to express high. Then, the dominant epitopes are fused with some functional fragments of PEA. At the same time, the carboxyl terminal sequence is added at the C end of the fusion protein and the immunogenicity is enhanced to increase the solubility of the fusion protein. The obtained fusion protein has the advantages of targeting, good antigenicity and high expression. The fusion protein as an antigen has the advantages of good safety, stable titer, non-toxic side effects and activation of cellular immune response.

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)属于圆环病毒科，单链、环状DNA病毒。主要分为无致病性的猪圆环病毒型(PCV1)和致病性的猪圆环病毒型(PCV2)。目前已知，Cap蛋白是PCV的结构蛋白，具有良好的免疫原性。2016年10月，美国Kansas州立大学的R.Palinski和加州大学SanFrancisco分校T.G.Phan等均报道一个新的PCV基因型，即称为PCV3。该病毒从发病母猪或仔猪中分离得到，同时PCV2检测为阴性。基因组序列分析发现，PCV3基因组包含2000个碱基，具有与PCVl和PCV2相似的基因组结构，主要编码cap和rep两个基因。猪圆环病毒型3在我国的猪场病例中被检测到，从流产母猪及发生皮炎肾病的小猪上发现大量的病毒数量，而且与猪圆环病毒型同时感染发病，引起较大的危害。PCV相关的疾病(PCVassociateddiseases,PCVAD)包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)、呼吸系统疾病(respiratorydisease)、繁殖障碍(reproductivefailure)和肠道疾病(entericdisease)等。特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，导致猪群免疫抑制，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒感染造成淋巴细胞的减少和淋巴细胞亚群比例失衡，造成免疫抑制。PCV主要在淋巴组织中增殖，感染可造成淋巴细胞衰竭、淋巴细胞凋亡。树突状细胞(Dendriticcells；DCs)在机体天然免疫和获得性免疫中都具有重要的作用。Vincent等发现80％的树突状细胞可与PCV相互作用，PCV可在树突状细胞中长期存在并维持感染性，但不会导致树突状细胞的病变和死亡，这是一种逃避DCs降解作用的新途径，也为病毒逃避免疫提出了一种新的机制。PCV感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力也下降，抑制性T细胞的活动增强，导致机体抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与呼吸综合征、支原体等，从而导致多种疫苗接种失败。猪圆环病毒全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗在机体的体液免疫方面发挥着一定的作用，但对于猪圆环病毒这种以细胞免疫为主的病原，如何通过细胞免疫来清除病毒是从根本上进行疾病预防的方向。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种融合蛋白，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述融合蛋白答制备方法，该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白。本专利技术的另一个目的在于提供一种能够表达上述融合蛋白的蛋白表达系统，可以直接快速大量得到上述融合蛋白。本专利技术的另一个目的在于提供上述融合蛋白的应用。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有上述融合蛋白的疫苗，该疫苗免疫原性好，效价高，以缓解现有技术中疫苗安全性低，效力差或不稳定，生产成本高并且保护率低等技术问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分；其中，所述单胞杆菌外毒素A结构域包括假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅰ和假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅱ。进一步地，所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段由SEQIDNO.3所示的核苷酸序列表达，所述羧基末端部分由包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列表达；优选地，所述羧基末端部分由SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示的核苷酸序列表达。进一步地，所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分的排列顺序为PEA-PCV2Cap-PCV3Cap-羧基末端，通过柔性氨基酸连接；优选地，所述柔性氨基酸具有如SEQIDNO.7所示的氨基酸序列。进一步地，在所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段和所述猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段之间还包括补体蛋白C3d；C3d可识别非己抗原，并促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈，促进免疫应答格局的转变、抗体类型的改变、提高中和抗体水平，是连接固有免疫和特异性免疫的桥梁。优选地，所述补体蛋白C3d由SEQIDNO.8所示的核苷酸序列表达。本专利技术还提供了上述的融合蛋白的制备方法，将编码所述融合蛋白的基因在宿主中表达。进一步地，使用哺乳动物表达系统表达编码所述融合蛋白的基因；优选地，使用CHO细胞表达系统表达编码所述融合蛋白的基因；优选地，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入CHO细胞中，然后对CHO细胞进行筛选，得到稳定表达所述融合蛋白的CHO细胞株，所述CHO细胞株表达得到所述融合蛋白；优选地，所述筛选包括加压筛选和单克隆筛选；优选地，所述制备方法中还包括将稳定表达所述融合蛋白的CHO细胞驯化为悬浮培养的步骤。本专利技术还提供了一种能够表达上述融合蛋白的蛋白表达系统。本专利技术还提供了上述的融合蛋白或上述的制备方法制备得到的融合蛋白在如下(A)-(D)任一项中的应用：A)制备猪圆环病毒疫苗；B)制备猪圆环病毒的抗体；C)制备检测猪圆环病毒的试剂盒；D)制备猪圆环病毒诊断抗原。另外，本专利技术还提供了一种含有上述的融合蛋白的疫苗。进一步地，所述疫苗中的融合蛋白的浓度为10-100μg/ml，优选为20-80μg/ml，更优选为50μg/ml；优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的至少一种；优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或ISA201RVG，优选使用ISA201RVG。本专利技术提供的融合蛋白，包括假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分。本专利技术通过筛选出去除PCV2和PCV3Cap蛋白的优势抗原表位，其抗原性好，易高表达，然后将各优势表位与PEA部分功能性片段融合，同时在融合蛋白C端加入了羧基末端序列以及增强免疫原性，增加了融合蛋白的可溶性。得到的融合蛋白具有抗原性好，表达量高的优点。将该融合蛋白作为抗原制备疫苗具有安全性好，效价稳定，无毒副作用的优势。本专利技术提供上述融合蛋白的制备方法，该方法将编码上述融合蛋白的基因序列在宿主中表达即可，具有制备方法简单、成本低廉、疫苗功能强大等优点。本专利技术提供能够表达上述融合蛋白的蛋白表达系统，该表达系统可以但不限为重组载体，重组细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分；其中，所述单胞杆菌外毒素A结构域包括假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅰ和假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅱ。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分；其中，所述单胞杆菌外毒素A结构域包括假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅰ和假单胞杆菌外毒素A结构域Ⅱ。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段由SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达，所述猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段由SEQIDNO.3所示的核苷酸序列表达，所述羧基末端部分由包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的核苷酸序列表达；优选地，所述羧基末端部分由SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示的核苷酸序列表达。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段、猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段、猪圆环病毒3型Cap蛋白优势抗原表位区段和羧基末端部分的排列顺序为PEA-PCV2Cap-PCV3Cap-羧基末端，通过柔性氨基酸连接；优选地，所述柔性氨基酸具有如SEQIDNO.7所示的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，在所述假单胞杆菌外毒素A结构域区段和所述猪圆环病毒2型Cap蛋白优势抗原表位区段之间还包括补体蛋白C3d；优选地，所述补体蛋白C3d由SEQIDNO.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，张伟，李俊辉，李延涛，程兰玲，高窦，潘晓梅，徐龙飞，师小潇，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65